179497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-kiválasztást befolyásoló biológiailag hatásos anyag előállítására Bordetella-pertussis felhasználásával
11 179497 12 terméke) oszlopra tápláljuk, és 0,5 M nátriumkloridot és 4 M karbamidot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral (pH = 7,0) eluáljuk. Ezután gélszűrést végzünk, így kapjuk az aktív anyagot. Az előállított aktív anyag molekulasúlya gélszűréssel kb. 72 000-nek adódik, az anyag 40 mg száraz por. Ennek kémiai összetétele kb. 95 súly% vagy ennél több protein, 1—2 súly% szénhidrát, lipoid nem mutatható ki. Az anyag fajlagos aktivitása 890 egység/jug. 6. Patogén Bordetella pertussis mikroorganizmusokat (I fázisú Tohama törzs) (Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) Bordet-Gengou táptalajon 37 °C-on 2 napig, majd Bordet-Gengou ferde tenyészetben 37 °C-on 20-40 órán át tenyésztünk. Ezután platinakaccsal kivéve, egy teljes kacs baktériumtenyészettel beoltunk aktívszénnel kevert, módosított szilárd Cohen-Wheeler táptalajt (CW táptalaj, összetétele az 5. táblázat szerinti), és 48 órán át 37 °C-on tenyésztjük. 5 kg így kapott nedves baktériumsejtet 5 liter desztillált vízben szuszpendálunk, és 1 órán át 56 °C-on tartjuk. A szuszpenziót lehűtjük, Thimerosalt (mertiolát) adunk hozzá 0,01% végső koncentrációig, és a baktériumsejteket centrifugálással (15 000 ford./perc, 30 percig) összegyűjtjük. A sejteket 4 M karbamidot és 1 M nátriumkloridot tartalmazó desztillált vízben szuszpendáljuk, és a baktériumsejteket ultrahanggal (Tomy Precision Machinery Co. készüléke) alacsony hőmérsékleten (4 °C) elroncsoljuk. Az így kapott szuszpenziót centrifugáljuk (15 000 ford./perc, 30 perc), és a csapadéktól mentes felülúszót vízzel dializáljuk, majd 0,1 M foszfátpufferral (pH = 0,6) egyensúlyba hozzuk, és 10 x 5 cm-es hidroxiapatit oszlopra tápláljuk. Az oszlopot az adszorbeált szennyezések eltávolítása céljából 0,01 M foszfátpufferral (pH = 0,6) és 0,1 M foszfátpufferral (pH = 7,0) mossuk, majd a keresett aktív anyagot 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral (pH = 7,0) eluáljuk. Az így kapott aktív anyagot 0,01 M foszfátpufferral (pH = 6,0) egyensúlyba hozzuk, és 2,5 x x 30 cm-es „CM-Sepharose CL-6B” oszlopra tápláljuk. Az oszlopot először 0,05 M foszfátpufferral (pH = 6,0) mossuk, majd 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral (pH =7,0) eluáljuk, így az aktív anyagot kapjuk. Az aktív anyagot koncentráljuk, és 4 M karbamidot és 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferban (pH = 7,1) feloldjuk, és az oldatot 2,5 x 115 cm-es „Sephacryl S—200” oszlopra vezetjük. Ezután oldószerrel eluálunk, így 40 mg aktív anyagot kapunk. Az anyag molekulasúlya gélszűréssel 74 000-nek adódik, kémiai összetétele: 95 súly% vagy ennél több protein, 2 súly% szénhidrát, lipoid nem mutatható ki. A fajlagos aktivitás 920 egység/jug. Az alábbi táblázat szemlélteti a használt Cohen-Wheeler-táptalap összetételét. A fenti szilárd táptalaj felhasználásakor a keveréket felmelegítve feloldjuk, az oldat pH-értékét 7,2-re beállítjuk, a táptalajhoz 5 g por alakú aktívszenet adunk, és autoklávban 121 °C-on 20 percig kezeljük. 5.táblázat Kazaminosav 10 g Élesztőkivonat 1 g Káliumdihidrogénfoszfát 0,5 g Oldható keményítő 1,5 g 0,5%-os rézszulfátoldat 1 ml 1%-os magnéziumklorid-oldat 1 ml Polipé pton 5 g 1%-os cisztinoldat 2,5 ml 0,5%-os vasszulfátoldat 1 ml Nátriumklorid 2,0 g Agar-agar, por alakú 18 g. Desztillált víz 1000 ml 7. Különböző affinitáskromatográfiás eljárások, amelyek az aktív faktor tulajdonságait hasznosítják, eredményesnek bizonyultak a találmány szerinti aktív anyag előállítására. Ezek az eljárások lehetővé teszik, hogy számos művelet megfelelő kombinációjával - amint azt az 1. példa 1. pontjában leírtuk - a műveletek egy részét elhagyjuk. A tisztasági fok és a hozam ennél a módszernél csaknem azonos az 1. példa 1. pont szerintivel. Az eljárást a következőképpen végezzük. A) Liofilizált és konzervált patogén Bordetella pertussis mikroorganizmusokat (I fázisú Tohama törzs) (Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) az 1. példa 1. pontja szerint tenyésztünk. A folyékony tenyészet 10 liter felülúszó részét hidroxiapatit oszlopra vezetjük (oszlopméretek 5x2 cm, átfolyási sebesség 60 ml/óra), és 300 ml 0,01 M foszfátpufferral (pH = 7,0) mossuk. Ezután az aktív anyag eluálása céljából 15 ml/óra sebességgel 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpuffert (pH = 7,0) vezetünk át az oszlopon. Az aktív anyagot „Ficol 400”-zal (a Pharmacia Fine Chemicals kereskedelmi terméke) kb. 15 ml-re koncentráljuk, majd négyszer (összesen 24 órán át) 2 liter desztillált vízzel és négyszer (összesen 24 órán át) 0,1 M nátriumkloridot tartalmazó 1 liter 0,01 M acetátpufferral (pH = 4,5) vagy 0,1 M lítiumkloriddal dializálva egyensúlyba hozzuk. Az így kapott terméket 5 ml/óra sebességgel 1,2x8 cm-es p-acetoximerkurianilin-Sepharose 6MB oszlopra vezetjük (lásd az alábbi előállítási módot), amelyet a fentivel azonos pufferral kiegyensúlyoztunk, az oszlopot ugyanezzel a pufferral jól átmossuk, és az aktív anyagot ugyanezzel a pufferral, amely 0,01 M L-ciszteint tartalmaz, eluáljuk. Az aktív anyagot összegyűjtjük, és „Ficol-400”-zal kb. 5 ml-re koncentráljuk, majd háromszor (összesen 12 órán át) 4 M karbamidot és 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 2 liter 0,1 M foszfátpufferral (pH = 7) szemben dializálva egyensúlyba hozzuk, és még a fenti pufferral is kiegyensúlyozzuk. A gélszűrést 2,8 x 95 cm-es „Sephacryl S200” (a Pharmacia Fine Chemicals kereskedelmi terméke) oszlopon végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
