179497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-kiválasztást befolyásoló biológiailag hatásos anyag előállítására Bordetella-pertussis felhasználásával
3 179497 4 riumkloridot adunk, és az aktív faktort így az oldatba kivonjuk. Az aktív faktor előállítására rendelkezésünkre áll a széles körben elterjedt ammóniumszulfátos kicsapás is. Ezt úgy végezzük, hogy a baktériumtenyészet felülúszó részéhez csaknem a telítettségi oldhatóság eléréséig szilárd ammóniumszulfátot adunk, és a pH-értékét hígított ammóniumhidroxiddal 6—7-re beállítjuk. Ezután a csapadékot vízzel mossuk, és az aktív faktort 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M trisz-pufferral (pH = 8) extraháljuk. Mint már említettük, a Pertussis bacillusok azok a Bordetella organizmusok, amelyek a találmány szerinti aktív faktort szolgáltatják, de ezeknek a kórokozó baktériumoknak a variánsai, például azok, amelyek különböző ismert behatások segítségével, például a táptalaj összetételének megváltoztatásával, különböző sugárfajtáknak, így ultraibolya vagy röntgenbesugárzásnak kitéve, vagy kémiai mutagének alkalmazásával, mutációval állíthatók elő, további használható forrásokat jelentenek az aktív faktor kitermeléséhez. A tenyésztéshez a találmány szerinti eljárásban bármely szokásos ismert módszer használható, de az aktivitás és kitermelés szempontjából a legelőnyösebbek a folyékony rázott tenyészetek. A Bordetella mikroorganizmusok mikológiái tulajdonságaira és tenyésztési körülményeire vonatkozóan utalunk a következő művekre: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Band 8, 1974., Baltimore, The Williams and Wilkins C.; J. Exp. Med. 129, 523—550 (1969); Micological Training Handbook, 3. Auflage, S. 6,1972., Maruzen and Co. A találmány szerinti eljárás a szigeteket-aktiváló-protein előállítására vonatkozik, amelynek kémiai azonosítása az alábbiakban ismertetett értékekhez és az inzulinkiválasztást elősegítő anyag további típusainak előállításához vezetett, amelyek a fenti aktiváló proteinnal gyakorlatilag azonos vagy azzal ekvivalens proteinek. A találmány szerint a szigeteket aktiváló proteinként előállított aktív faktor kémiai és fizikai tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük. Viselkedési mód és oldhatósági tulajdonságok: Az aktív faktor sómentesített és liofilizált pora nem-elfolyósodó, fehér vagy barnás, szobahőmérsékleten vízben kb. 3—5 mg/ml koncentrációban oldódik. 6 n sósavban oldhatatlan fehér csapadékot képez. Oldódik piridinben, nátriumdodecilszulfátban, 2-merkapto-etanolban és cisztin-oldatban. Ha a tisztított aktív anyag oldatához hidegen (4 °C) szárazjeget adunk acetonban vagy etanolban, vagy triklórecetsavat, cinkkloridoldatot, vagy más különböző típusú fémionokat tartalmazó egyéb oldatokat adunk, akkor fehéren zavaros csapadék képződik. Az aktív faktor víz és kloroform, vagy n-butanol keverékében oldhatatlannak mutatkozik, és a két folyadék határfelületén gyűlik össze. Ha az aktív faktor vizes oldatát 80 °C-ra, vagy ennél magasabb hőmérsékletre melegítjük, fehéres zavarosodás lép fel. Ha az aktív faktort 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferban (pH = 7,0) oldjuk, és az oldatot külső folyadékként desztillált vizet alkalmazva dializáljuk, az aktív faktor időszakosan fehéren zavaros lesz, de a dialízist tovább folytatva újra tökéletesen feloldódik, és a fehér zavarosodás eltűnik. Ha egy nagykoncentrációjú oldatot 0,01 M acetátpuffer (pH = 4,5) alkalmazásával alaposan dializálunk, akkor az aktív faktor kissé barnás színű és oldott állapotú lehet. Molekulasúly: A aktív faktor molekulasúlya 77 000 ± 6400-nak adódott gélszűréssel meghatározva, amit 2,8 x 80 cm oszlopon Biogel P-100-zal (a BIO, RÁD Corp. kereskedelmi terméke) végeztünk, az oszlopot előzőleg 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M foszfátpufferral egyensúlyba hozva. összetétel: A proteintartalom a Lowry-eljárással meghatározva 95 súly% felett van, a glucidtartalom [a glucidokat 1. Hackle’s Chemical Dictionary, 4. Aufl. McGraw-Hill Book 60. S. 300] a fenol-kénsav eljárással meghatározva kb. 1 súly%. A lipidkoncentráció a kimutathatóság alsó határa alatt van. A megadott komponensek mérésére alkalmazott módszereket a következő irodalmi helyek ismertetik: Protein: Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall: J. Biol. Chem. 193, 265. (1951). Glucidok: (E helyen és a következőkben ezen a néven nevezzük az alábbi eljárással meghatározható cukrokat és származékaikat) Phenol—H2S04—Methode nach Dobois, M., K. A. Giles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers und F. Smith: Anal. Chem. 28,350(1956). Lipidek: Az összes lipidet és lipidkonjugátumot Marsh és Weinstein módszerével [J. B. Marsh und D. B. Weinstein: J. Lipid Res., 7, 574 (1966)] mértük, az anyagot hidrolízis előtt és után kloroformmal, kloroform-metanol keverékével és heptánnal extrahálva. A proteinkomponens aminosavösszetétele (átlagmennyiség /iM 1000 juM, 16 vagy 24 órás hidrolízis 110°C-on 6 n sósavban) a következő: aszparaginsav 7,5, treonin 7,3, szerin 6,4, glutaminsav 10,0, prolin 5,8, glicin 8,8, alanin 9,3, cisztin/2 2,5, valin 6,5, metionin 2,8, izoleucin 4,0, leucin 7,8, tirozin 6,5, fenilalanin 3,7, lizin 3,3, hisztidin 1,5 és arginin 6,4. Izoelektromos pH-érték: 8,4 ± 0,5. Discelektroforgram: Az akrilamid-discelektroforézist (7,5% poliamid-koncentráció, 1 n káliumhidroxid-jégecet puffer, pH =4,3) az alábbi körülmények között végezzük: 30 jug minta, 4 mA áramerősség, 2 h/gél időtartam, a gél festését Amidoschwarz 10B-vel és a mosását 7%-os ' ecetsavoldattal végezzük. 2,221 ± 0,061 cm 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
