179497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-kiválasztást befolyásoló biológiailag hatásos anyag előállítására Bordetella-pertussis felhasználásával
5 179497 6 távolságban egyetlen, igen éles sávot kapunk (vonatkozási pont a távolságtartó betét). Biológiai tulajdonságok: A találmány szerinti aktív faktor emlős állatoknál inzulinkiválasztást elősegítő és glükóztoleranciát javító hatást fejt ki, és ezek a hatások egyetlen dózissal több héten, ill. több hónapon át tartanak. Az akut toxicitás (LDS0) kb. 200/ag/kg testsúly egereknél (ddy törzs) intravénás injekcióban beadva. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről a példák szemléltetik. 1. példa A biológiailag hatásos, protein-jellegű anyag előállítása 1. Liofilizált és konzervált patogén Bordetella pertussis (I fázisú Tohama törzs) mikroorganizmusokat (Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) Bordet-Gengou táptalajban 37 °C-on lemezmódszerrel 2 napig tenyésztünk, majd platinakaccsal egy teljes kacs baktériumtenyészetet 500 ml-es rázólombikba oltunk, amelybe az alábbi 1. táblázatban megadott összetételű, módosított Cohen-Wheeler táptalaj (CW-táptalaj) hozzáadása mellett 200 ml ioncserélő gyantát adunk, és 37 °C-on 20—22 órán át mint rázott tenyészetet tenyésztjük. A tenyészlében a baktériumkoncentrációt spektrofotométerrel mérjük (X = 650 nm), és ezt az oldatot 2 literes rázólombikba visszük át, amelybe CW-táptalajjal kevert ioncserélőgyantát olyan mennyiségben adagolunk be, hogy a végső baktériumkoncentráció 0,1 x 109 csíraszám/ml, és ezután a rázott tenyészetet (rázófrekvencia 97/perc) 37 °C-on 48 órán át tenyésztjük. A megadott törzs bakteriológiai tulajdonságai összhangban vannak azokkal, amelyeket a fenti irodalom a Bordetella pertussis I fázisú törzsekre ismertet. Az alkalmazott Cohen-Wheeler táptalaj (CW-táptalaj) összetételét az 1. táblázat szemlélteti. 1. táblázat „Kazaminosav”x 10 g Élesztőkivonat 1 g Kálium di hidrogénfoszfát 0,5 g Oldható keményítő 2g 0,5%-os rézszulfátoldat 1 ml 1%-os kalciumkloridoldat 1 ml 4%-os magnéziumkloridoldat 1 ml Polipepton 5g 1%-os cisztinoldat 2,5 ml 0,5%-os vasszulfátoldat 1 ml Nátriumklorid 2,5 kg XA kazaminosav a kazeinnak egy savas hidrolizátuma. Felhasználáskor ezt a folyékony táptalajt desztillált vízzel 1000 ml össztérfogatra feltöltjük, a pH-értékét 20%-os nátriumhidroxid-oldattal 7,2-re beállítjuk, majd még 3 g anioncserélő gyantát („Diaion SA-20 AP’’, a Mitsubishi Kaséi Co. kereskedelmi terméke) adunk a táptalajhoz, és 15 percig autoklávban 121 °C-on kezeljük. A 48 órás tenyésztés után kapott rázott tenyészlét 30 percig 56 °C-on tartjuk, majd 4 °C-on centrifugáljuk (15 000 ford./perc), s így szétválasztjuk a felülúszó részre és a baktériumsejtekre, majd a tenyészlé így kapott felülúszó részét használjuk mint kiindulási anyagot a találmány szerinti aktív faktor tisztítására és izolálására. 10 liter felülúszó pH-értékét 1 n sósavval 6,0-ra beállítjuk, majd 200 ml/óra sebességgel 2,5 x 4 cm-es hidroxiapatit oszlopra tápláljuk. Ez az első izoláló, illetve tisztító művelet. A proteinek nagyrésze áthalad az oszlopon, anélkül, hogy azon adszorbeálódna, és ebben a frakcióban a keresett inzulinkiválasztó aktivitás (lásd a később ismertetett aktivitás-mérésmódszert) alig mutatható ki. A proteinkoncentrációt Lowry és társai eljárásával (vö. a 2. táblázat lábjegyzetével) mértük. Az adszorbeált anyagok meghatározása céljából az oszlopot először 0,01 M foszfátpufferral (pH = 6,0) mossuk, és ezt követően a foszfátpuffer moláris koncentrációját 0,1-re és pH-értékét 7,0-re növelve, az adszorbeált proteineket fokozatosan eluáljuk. A találmány szerinti aktív faktor azonban ilyen körülmények között nem eluálódik. Ezért ezt követően azonos összetételű, de 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó foszfátpufferral még egy eluálást végzünk. Ilyen körülmények között sikerül a találmány szerinti aktív faktort jó hatásfokkal eluálni, összhangban az 1. ábrán feltüntetett proteinfrakcióval. A foszfátpuffer jelölése a P. B. Az így kapott aktív faktort koncentráljuk, és dializáló membránba tesszük (Thomas Cat. Nr. 3787—F25), amelynek áteresztőképessége 8000 molekulasúlyra a legnagyobb, és kétszer (összesen 12 órán át) desztillált vízzel és kétszer (összesen 12 órán át) 0. 01 M foszfátpufferral (pH = 6,0) dializáljuk. További tisztítás céljából a dializált aktív faktort tartalmazó oldatot 1,5 x 10 cm-es „Carboxymethyl Sepharose CL—6B” oszlopra tápláljuk, amit 0,01 M foszfátpufferral (pH = 6,0) egyensúlyba hoztunk. Az utóbbi oszloptölteten nem adszorbeált anyagok aktivitást nem mutattak. Ezután a foszfátpuffer moláris koncentrációját 0,1-re, illetve pH-értékét 7,0-re növeltük, és hasonló eluálást végeztünk 0,5 M nátriumklorid hozzáadásával. így a 2. ábra szerinti eluált proteinfrakcióval összhangban kaptuk a találmány szerinti aktív faktort. (A 2. ábra rövidítései azonosak az 1. ábráéval.) Mivel az így kapott termék discelektroforézissel kimutatható kevés szennyezést még mindig tartalmaz, az aktív faktort tovább koncentráljuk, és a fenti típusú dializálómembránba tesszük, kétszer (összesen 12 órán át) desztillált vízzel és kétszer (összesen 12 órán át) 0,01 M foszfátpufferral (pH = 7,0) dializáljuk, és a dializált mintát 1,5x8 cm-es „Con A-Sepharose 4B” oszlopra vezetjük, amit 0,01 M foszfátpufferral (pH = 7) egyensúlyba hoztunk. Ugyanezzel a pufferoldattal kifejlesztve csupán nyomokban eluálunk egy proteint, de ez a proteinfrakció aktivitást nem mutat. Tovább eluálva 0,1 M foszfátpufferral (pH = 7,0), amely 0,5 M nátriumkloridot tartalmaz, a 3. ábra szerinti eluált proteinfrak-3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
