179425. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citromsav előállítására
3 179425 4 A fenti törzzsel (CMPM Y-184 Candida lipolytica) és a megadott pH-értéken végzett fermentáció során a citromsav 237,3 g/liter koncentrációig dúsul fel a fermentlében, és a hozam - a bevitt n-alkánokra vonatkoztatva - 158 súly%-ot tesz ki (vízmentes cit- 5 romsavra átszámítva a koncentráció 217 g/liter, a hozam 145 súly%). A találmány értelmében alkalmazott törzs továbbá azzal tűnik ki, hogy gyakorlatilag csak citromsavat terme) (a citrát: izocitrát aránya 36 :1), ami a citromsav elkülönítését a fermentléből jelentő- 10 sen megkönnyíti. A végtermék hozamát fokozhatjuk, ha a fermentációt olyan közegben végezzük, amelyben az oxigén-koncentráció a telítettségi érték 50-90 súly%-ának felel meg. A pH-érték célszerű 5,0 és 7,0 között van. 15 A fermentáció során célszerű legalább egy 12—19 szénatomszámú n-alkánt használni. A találmány szerinti eljárás alkalmazása lehetővé teszi, hogy a citromsavat ne valamely élelmiszeripari nyersanyagból, hanem n-alkánból állítsuk elő,olyan 20 kitermeléssel, mely az e területen ismert eredményeket felülmúlja. A találmány szerinti eljárással előállított citromsav önköltsége lényegesen alacsonyabb, mint például a melaszból előállított citromsavé. A citromsav előállítására szolgáló, találmány sze- 25 rinti eljárás megvalósítása az alábbiak szerint történik. A CMPM Y-184 Candida lipolytica élesztőt nitrogénforrást, foszfor-forrást és más ásványi sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük, szén-forrásként legalább j0 egy 12-19 szénatomszámú n-alkánt alkalmazunk. A táptalajhoz hozzáadjuk a mikroelemek keverékét és a vitamin-forrásként szolgáló élesztőautolizátumot. A tenyésztést levegőztetés közben, 50-90 súly%-os telítettségű oxigén-koncentráció és legfeljebb 8,0 pH-érték mellett, 28-30 °C-on 84-144 óráig végezzük. Az oltóanyagot a következőképpen készítjük el. Ferde-agaron 3 napig tenyésztett CMPM Y—184 Candida lipolytica-t szuszpenzió formájában a tápoldathoz adjuk, majd lombikban 200 perc-1 frekvenciájú 40 rázóasztalon 28-30 °C-on 48 órán át tartó inkubálás után használjuk fel a táptalaj beoltására. A fermentálás után a fermentlé citromsav-koncentrációja 237,3 g/liter, a monohidrátban kifejezve, a sav kitermelése a bevitt n-alkán súlyára vonatkoztatva 45 158 súly%. A CMPM Y-184 Candida lipolytica törzs az IBFM Y-160 (704) törzs sejtjeinek nitrozometil-karbamidos kezelésével és az azt követő kiválasztással állítható elő. A mutációs törzset 1978. II. 1-én helyeztük 50 letétbe a WNII Genetikai Intézet Mikrobiológiai Ipari Kultúrák Múzeumában. A CMPM Y-184 Candida lipolytica törzs tulajdonságai az alábbiak: • Folyékony és agarizált cefrén, a fiatal kultúra ovális és kissé megnyúlt, 5,0 x 3,0-10,0 gm méretű sej- 55 tekből áll. Hőfordulnak 2,4 x 11,0-16,0 pm nagyságú erősen megnyúlt sejtek és 3-4 sejtből álló láncok is. Folyékony cefre táptalajon 25 °C-on a 8. napon a közeg felületén vékony film képződik, és az üvegcső ^ alján csapadék képződik. A 25-16. napon a film megvastagodik és a csapadék mennyisége növekszik. A cefre agaron képződött telepek (10 naposak) világos krémszínűek, egyenletesek, fénytelenek, domborúak, a telepek közepe enyhén kiemelkedik, szélük ^ sima. A nagy telepek krémszínűek, szélükön sárgászöldek, enyhén ráncosak, laposak, közepük kiemelkedik, a szélük enyhén lapátszerű. A hosszúkás képződmények laposak, egyenletesek, fénytelenek, krémszínűek, széleik simák. A burgonya-agaion tenyésztett kultúrák üvegen: a pszeudomicéliumok gyengén fejlettek, erősen aerobok. A törzs a cukrot nem erjeszti, glükózt, etanolt, acetátot, glicerint asszimilálja. Galaktózon gyenge növekedés tapasztalható. Laktózt, maltózt, szacharózt, rafinózt, arabinózt, xilózt, keményítőt nem asszimilálja. Nitrogén-forrásként ammónium-szulfátot és -kloridot használhatnak. Nitrátokon nem tenyészthető. A tejet teljesen peptonizálja. Az ideális tenyésztési hőmérséklet 26—30 °C, legfeljebb 33 °C. A mikroorganizmus Rieder szerint agarizált közegben paraffinnal és ampullákban liofilizált állapotban tárolható. Az ismertetett CMPM Y-184 Candida lipolytica törzsnek az a különleges tulajdonsága, hogy n-alkánt tartalmazó táptalajon történő tenyésztésnél csak citromsavat termel, az izocitromsav mennyisége gyakorlatilag elhanyagolható. A CMPM Y—184 Candida lipolytica mutáns stabilitásának vizsgálata céljából azt 4 hónapon át, friss paraffinos közegre átoltottuk (a tenyésztés rázóasztalon, lombikban történt), összesen 40 egymást követő passzázsban. Ezek során a kultúrák nem vesztették el azt a képességüket, hogy elsősorban citrátot termeljenek, sőt a citrát: izocitrát aránya még inkább a citrát javára tolódott el. A kultúra előnyös tulajdonságai még akkor sem változtak, amikor a mutációs törzset 6 éven keresztül agarizált táptalajon tartottuk. Valamennyi vizsgálat során megmaradt a CMPM Y-184 Candida lipolytica mutációs törzsnek az a gyakorlati szempontból leglényegesebb tulajdonsága, hogy n-alkánt tartalmazó táptalajon a citrátot előnyösen termeli. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal illusztráljuk: 1. példa A Candida lipolytica CMPM Y-184 törzset Reader féle agarközegen tenyésztjük. A közeg összetétele az alábbi: Ci 2 -Ci 9 -alkánok elegye ammónium-szulfát magnézium-szulfát-heptahidrát nátrium-klorid kálcium-nitrát kálium-dihidrogén-f oszfát dikálium-hidrogén-foszfát élesztő-autolizátum Burkholder-féle mikroelem-adalék agar 10.0 g/liter 3.0 g/liter 0,7 g/liter 0,5 g/liter 0,4 g/liter 1.0 g/liter 0,1 g/liter 2 ml 25.0 g/liter A Burkholder-féle mikroelem-adalék az alábbi koncentrációkat (mg/liter közeg) biztosítja: káliumjodid 0,1, bór 0,01. Mn2* 0,01, Zn2* 0,01, Cu2* 0,01 Mo6* 0,01, Fe2* 0,05. 2
