179354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kondenzált izotiazol-3(2H)-on-1,1-dioxidok és ezeket tartalmazó édesítőszerek előállítására
7 8 179354 1%-os oldat nem okoz pupilla-tágulást, sem helyi érzéketlenséget. A C vegyület nem befolyásolta az izolált patkányszív pitvarának összehúzódó képességét és frekvenciáját. A C vegyület 1,0 3,0 és 10,0 mg/kg testsúly perorális adagja nem befolyásolta a narkotizált macskák vérnyomását, szívfrekvenciáját és lélegzését. A C vegyület 1 x 10"4 mól/liter töménységű oldatban nem befolyásolta egészséges kísérleti személyek lemeztestekben gazdag vérplazmájában a trombociták ADP-indukált, trombin-indukált és kollagén-indukált aggregációját. Vízzel terhelt hím patkányoknál a Na+, K+, Cl" és folyadék-kiválasztást 200 mg/kg testsúly perorális adagolásig a C vegyület nem befolyásolta. A C vegyület sem bakteriosztatikus, sem fungisztatikus szempontból nem hatásos. e) Tájékoztató akut toxidtás Az akut toxicitást a vegyületek hím és nőstény egereknek, valamint hím és nőstény patkányoknak való perorális beadásával határoztuk meg. A vegyületeket vizes oldatként vagy tílózzal készített szuszpenzió formájában adtuk be. Az alábbi táblázatban a feltüntetett adagok beadása után, 1-7 napon belül 2's kimúlt állatok számát adjuk meg. Vegyület Adag Állat mg/kg Állatok száma A megfigyelési idő alatt 1 nap 7 nap alatt elpusztult állatok száma A 1000 egér 6 0 0 C 5000 egér 6 0 0 C 5000 patkány 6 0 0 D 5000 egér 6 0 0 E 1000 egér 6 0 0 A megfigyelés időtartama alatt az állatokon nem tapasztaltunk toxikus tüneteket, az állatok a kísérlet során megszokott módon viselkedtek. f) A mutagén hatás vizsgálata Egy édesítőszerrel szemben támasztott legfontosabb követelmény az, hogy egészségi szempontból ártalmatlan legyen. Ezt a követelményt azonban a legtöbb édesítőszer nem elégíti ki. így például a szacharinnak mutagén hatása van [R. P. Batzinger, S.Y.L. On, E. Bueding, Science 198, 944 (1977)], és ez a tulajdonsága kérdésessé teszi édesítőszerként való alkalmazhatóságát. A C és D hatóanyag mutagén tulajdonságait az AMES-rendszer szerint (Mutation Research 31, 347-364 (1975)] vizsgáltuk. Az indukált, molekuláris DNA-károsodások teljes spektrumának (bázisszubsztitúció, keresztmutádó, deládó) kimutatásához genetikus indikátorként Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 és az Escherichia coli WP 2 (P) auxotróf baktérium-törzseket használtuk, valamint a C vegyülethez a Salmonella typhimurium TA 1535, TA 1537 és TA 1538 törzseket is. A mikroorganizmusokhoz a vizsgálatokat úgy szerkesztettük meg, hogy megvizsgálható volt a megfelelő kofaktoros enzim-rendszernek a hatóanyagra gyakorolt hatása, valamint az enzim-indukcióban 5 mutatkozó különbségek. A vizsgálatot aktiváló rendszer hozzáadásával és anélkül végeztük. Az in vitro aktiváláshoz normális, azaz kezeletlen patkányok, valamint Aroclor 1254-gyel (500 mg/kg) indukált .patkányok S—9 szövetmetszeteit (endoplazma reti- 10 kulumjának darabjait) használtuk. Az indukált S—9 frakcióból három különböző koncentrádó-fokozatot vizsgáltunk meg. A hatóanyag-koncentráció a C vegyületnél 0,1-0,5 mg/lemez, és a D vegyületnél 5, 10, 15 és 15 20 mg/lemez volt. Egy ezt megelőző hígítási sorozat vizsgálatnál a legnagyobb adagoknál még nem tapasztaltuk a mikroorganizmus fejlődés gátlását. A C és D vegyület a vizsgált törzsek egyikénél sem okozta a spontán mutádós arány növekedését. .20 Az enzimindukció és az aktiváló frakció hatása a mutádós jelenségek visszaalakítására nem volt kimutatható. A lemezeken megszámlált kolóniák az adott vizsgáló-törzs spontán tartományán belül voltak. A kísérletek azt mutatták, hogy a C és D vegyület nem vált ki bázisszubsztitúciót [S. Typhimurium TA 1535, TA 100, E. coli WP 2 (P)], sem frameshift-mutádót [S. typhimurium TA 1537, TA 1538, 30 TA 98] és így nem utalnak a C és D vegyület mutagén képességére. Az alábbi példák szemléltetik a találmány szerinti eljárást. A hőmérséklet értékeket °C-ban adjuk meg. 1. példa 5-Metil-furo[3,2-d]izotiazol-3(2H)-on-1,1-dioxid 20,5 g (0,1 mól) 5-metil-2-szulfamoil-furán-3-karbonsavat és 20,8 g (0,1 mól) foszforpentakloridot 50 ml vízmentes toluolban 8 óra hosszat visszafolyatás közben forralunk. A forró reakciókeveréket 45 szűrjük, lehűlés után 11,8 g (62,5%) 5-metil-furo[3,2-d]izotiazol-3(2H)-on-l,l-dioxid kristályosodik ki. Kétszer átkristályosítjuk benzolból, 6,9 g (37%) cím szerinti vegyületet kapunk, olvadáspontja 195- -196° (bomlik). 50 IR (KBr): 1730 és 1690 cm"1 (CO), 1H-NMR (CDCI3 + CD3OD): 5 =6,5 (s, 1, 4-H), 2,5 (s, 3, CH3), és egy helyettesíthető proton MS: M+ 187 m/e. A kiindulási vegyületet az alábbi módszerrel 55 állítjuk elő: 260 g (3,17 mól) 2-metil-furánt és 507 g (3,17 mól) kéntrioxid-piridin-komplexet 1 liter etilénkloridban 3 napon át keverünk. Ezután a reakciókeveréket 3 liter meleg vízhez keverjük. A vizes fázist 60 elválasztjuk, és nátriumkarbonáttal a pH-értékét 7,5-re állítjuk be, majd szárazra pároljuk. A maradékot visszafolyatás közben többször egymás után izopropanollal extraháljuk, a kihűlt izopropanolos oldatból 248 g (43%) 5-metil-furán-2-szulfonsav-nát- 65 riumsó kristályosodik ki. 4
