179350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás G-6302 antibiotikum előállítására
7 179350 8 Az így előállított termék hatékonyságának vizsgálatát például a Proteus mirabilis IFO 3849 organizmussal végezhetjük el, standardként G—6302-t használva, a henger módszerrel vagy a papír tárcsa módszerrel, TSA (triptikáz szója agar) (Baltimore Biologicals, Limited, U.S.A.) alkalmazásával. A G-6302 antibiotikum kinyerhető mikrobiológiai metabolitok kinyerésére használatos módszerek bármelyikével. így például, a sejteket centrifugálással elkülöníthetjük és az aktív anyagot a felül elhelyezkedő rétegből kivonhatjuk és megtisztíthatjuk, a szokásos módszerekkel. Ilyen módszerek például, amelyek az oldhatóságot vagy oldhatóságbeli különbséget használják ki alkalmas oldószer megválasztásával, vagy az antibiotikumnak az oldatból történő kicsapódását, illetve a kicsapódás mértékében jelentkező különbséget hasznosítják, vagy olyan módszerekkel melyek a különböző adszorbenseken való adszorptív affinitásbeli jellemzőket használják ki. Használhatunk továbbá ioncserélési kromatográfiát ion-cserélőkön, csökkentett nyomáson történő betöményítést, fagyasztva szárítást, kristályosítást, átkristályosítást, szárítást stb., melyeket egyedül vagy alkalmas kombinációkban és egymás után is alkalmazhatunk és/vagy ismételhetünk. Az alábbiakban egy jellemző folyamatot is ismertetünk. Eszerint, miután a tenyésztést befejeztük, a ferment-levet leszűrjük és a kapott szűrletet egy aktív szénnel töltött oszlopon engedjük át, és az adszorbeált G-6302-t valamely hidrofil szerves oldószerrel eluáljuk. Hidrofil szerves oldószerként például említjük a rövidszénláncú ketonokat (például aceton, metiletil-keton, metil-izobutil-keton stb.), rövidszénláncú alkoholokat (például metanol, etanol, izopropanol, propanol, butanol stb.). Ezek az oldószerek használhatók egyedül vagy egymással és vízzel való kombinációban. A G—6302 savas természete miatt anioncserélő gyanták, például Cl-formájú gyanták, előnyösen használhatók. (Például Amberlit IRA-400, és 402, gyártja az Amberlit Co. U.S.A. vagy Dowex—1, Dow and Chemical Co. U.S.A., Diaion SA-21A, Mitsubishi Chemical Industries, Japán). Az adszorbeált aktív terméket például nátriumklorid vizes oldatával eluáljuk. Az eluátum sótalanítása érdekében azt ismét aktív csontszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. A kapott eluátumot ezután betöményítjük, acetont adunk hozzá és a kapott csapadékot szűréssel elkülönítjük. Acetonnal, majd dietil-éterrel mossuk, és csökkentett nyomáson szárítjuk. Vüágos-bama port kapunk. A porban levő G—6302 tisztítása érdekében DEAE-Sephadex (Pharmacia, Sweden) oszlopon való kromatografálást használhatjuk előnyösen. A DEAE-Sephadex A-25-ös oszlopot 0,01M-os foszfát pufferrel mossuk (pH 6,6) és a fenti por vizes oldatát átengedjük az oszlopon, amelyen az antibiotikum adszorbeálódik. Az oszlopot ugyanazzal a pufferrel mossuk, mint fent, az eluálást pedig 5 súly/térfogat%-os nátrium-kloridot tartalmazó puferrel végezzük. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, a pH-ját 3-ra állítjuk be és ismét átengedjük az aktív csontszenet tartalmazó oszlopon. Az oszlopot vízzel és 20 térfogat%-os vizes metanollal egymást követően mossuk. Az eluálást vizes acetonnal végezzük, az aktív frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson betöményítjük. A koncentrátumhoz acetont adva megkapjuk a G—6302-t. A G—6302 fémsókat és ammóniumsókat képez. A fémsók közül megemlítjük a nátriumsót, kálium és lítiumsót stb. Az 1. példa szerint (lásd később) előállított O—6302 fiziko-kémiai sajátságai az alábbiak: 1. Olvadáspont: 120 ÖC (zsugorodik), 130 °C (bomlik) 2. Megjelenése: fehér por 3. Elem-analízis: (miután csökkentett nyomáson foszfor-pentoxid jelenlétében 40 °C-on 60 óráig szárítottuk) (%): C 34,83 35,45 (34,99 ±0,5) H 5,41 5,24 (5,58 ±0,5) N 13,22 13,73 (13,60 ±0,5) S 7,65 7,75 (7,70 ±0,5) O (38,13 ±0,5) 4. Molekulasúly: Titriometria: 400 ± 20 Tapasztalati képlet (a fenti adatok alapján) C12H20N4SO9 ■ H2O Számított: C = 34,78, H = 5,35, N = 13,52, S = 7,74 5. Ultraibolya abszorpciós spektrum: Csak sáv-végi abszorpció (nincs jellemző abszorpciós spektrum 210 nm felett) 6. Infravörös abszorpciós spektrum (Fig. 1.) domináns csúcsok (KBr) (cm'1, 3440(s), 2920(m), 2850(M), 2600(w) 1770(s), 1650(s), 1530(s), 1458(m), 1390(w), 1340(w), 1280(sh), 1240(s), 1210(sh), 1180(m), 1118(w), 1043(s), 792(w), 632(s), (s, m és w jelentése: erős, közepes és gyenge abszorpció, sh jelentése váll). 7. Fajlagos rotáció: (a)D3 + 94° ± 10° (c = 0,35, H20) 8. Magrezonancia spektrum (dimetüszulfoxidban, 100 MHz 53,31 ppm/s, 0-CH3-ra utaló kémiai eltolódás) 9. Oldhatóság oldószerekben: oldhatatlan petrol-éterben, hexánban, dietil-éterben, benzolban, etilacetátban, és kloroformban, kismértékben oldódik etanolban, piridinben, és acetonban, oldható metanolban és dimetilszulfoxidban, jól oldódik vízben. 10. Színreakciók: Pozitív: ninhidrin és kálium-permanganát reakciók, negatív: vas-klorid-kálium-ferricianid, Sakaguchi és Molish reakciók/ kétes pozitív: Ehrlich reakció. 11. Stabilitás: Vizes oldatokban stabil 3-7-es PH tartományban 60 °C-nál 10 percig, nem stabil 8,5-ös pH felett 5 10 15 20 2'5 30 35 40 45 50 55 60 65 4
