179350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás G-6302 antibiotikum előállítására
5 179350 6 gey féle „Manual of Determinative Bacteriology” 7. és 8. kiadás tartalmaz, nyilvánvaló, hogy a G—6302 törzs a Pseudomonadaceae családhoz tartozik, tekintve, hogy egy Gram-negatív pálcika alakú, szigorúan aerob, poláris csilló vagy csiliók segítségével mozgó, és kataláz-pozitív baktériumról van szó. Az a tény, hogy a baktérium tápldkoz.ási szükségletet nem mutat, és hogy a GC tartalma 59,5 mól%, arra utal, hogy a törzs a Pseudomonas nemzetséghez tartozik. A fenti jellemzők alapján a G—6302 törzshöz viszonylag hasonló Pseudomonas baktériumok közül megemlítjük a Pseudomonas syringae és a Pseudomonas maltophilia törzseket, melyek cytochrom oxidáz negatív baktériumok. A P. maltophilia azonban nyilvánvalóan különbözik a G—6302 törzstől, amennyiben a P. maltophilia metionin-igénylő és 4 °C-on nem mutat növekedést. A Pseudomonas syringae viszont olyan fej, beleértve nagy számú alfaját is, amely mint az a 2. táblázatból kitűnik, nem képes hasznosítani bizonyos szén-forrásokat, mint az ilyen fajokra általánosan jellemző, a G—6302 törzsre viszont nem. 2. Táblázat Különböző szén-fonások asszimilálhatóságának összehasonlítása Szén-fonás Pseudomonas G-6302 syringae törzs Trehalóz + 2-ketoglukonát — 4-béta-alanin — + L-izoleucin+ +: asszimilálja, —: nem asszimilálja Továbbá, a G—6302 faj növekedéséhez szükséges optimális pH érték igen alacsony, nevezetesen, 4,5-6,0 közötti, de még 4,0-es pH-nál is növekszenek. Ezek a különbségek kizárják annak a lehetőségét, hogy a G—6302 törzset a Pseudomonas syringae törzshöz tartozónak tekintsük. Ezért úgy ítéljük meg, hogy a G—6302 a Pseudomonas nemzetség egy új törzsének tekinthető. Továbbá, tekintettel ezeknek az alcsonÿ optimális növekedési pH értékére, amely 4,5-6,0 között van, és amely a Pseudomonas nemzetséghez tartozó baktériumokhoz képest elég alacsony, a G-6302 törzset Pseudomonas acidophila G—6302-nek neveztük el. Ennek a G—6302 törzsnek a mintáit elhelyeztük a Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FERM)-nál Chiba, Japán, FERM—P No. 4344 letét számon, továbbá az Institute for Fermentation-nd, Osaka (IFO) Japán, IFO 13774 számon, és az American Type Culture Collection-ben (ATTC) Maryland, U.S.A. ATCC—31363 számon. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott Pseudomonas baktériumok jellemző vonásaikat tekintve nagyon változékonyak és könnyen képeznek mutációkat, ha mesterséges mutagén kezelésnek véljük alá, például ultraibolya fénnyel vagy röntgensugárzással megvilágítjuk vagy kémiai mutagénekkel kezeljük. A találmány szerinti eljárás céljaira azonban bármelyik, vagy az összes ilyen mutáns illetőleg variáns használható, amennyiben a G—6302 termelőképességüket megőrzik. A G—6302 törzs tenyésztéséhez használható szén-források közül alkalmazható a glükóz, szacharóz, maltóz, melasz, glicerol, olajok és zsírok (például szójabab olaj, olívaolaj, stb.) szerves savak (például citromsav, borostyánkősav, glukonsav stb.) és más asszimilálható szerves anyagok. Nitrogénforrásként használhatunk szerves és szervetlen nitrogéntartalmú vegyületeket és anyagokat, pddául szójabab lisztet, gyapotmag lisztet, kukorica áztató folyadékot, szárított élesztőt, élesztő kivonatot, húskivonatot, peptont, karbamidot, ammónium-foszfátot stb. Továbbá, a baktérium tenyészetekhez általában szükséges szerves sókat, például nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalcium-karbonátot, magnéziumszulfátot, kálium-dihidrogén-foszfátot, dinátrium-hidrogénfoszfátot stb. használhatjuk egyedül vagy alkalmas kombinációban. Azt találtuk, hogy az antibiotikum termelés növelhető, ha a táptalajt kénvegyületekkel egészítjük ki, melyeket a G-6302 termelő baktérium hasznosítani tud. Dyenek lehetnek szervetlen kénvegyületek, mint például szulfátok (nátriumszulfát), tioszulfátok (nátriumtioszulfát) stb., vagy szerves kénvegyületek mint például kéntartalmú aminosavak (pddául cisztin, cisztein, metionin) stb. E célra a nátrium-tioszulfát különösen előnyös. A táptalajban a kénvegyületek koncentrációja 0,01 és 1,0 súly/térfogat% között lehet, de célszerűen 0,02 és 0,5 súly/térfogat% között. Az ilyen kénvegyületeknek a táptalajhoz való adagolása növeli a G—6302 kihozatalt, tehát gazdasági jelentősége van. Továbbá, adott esetben nehézfémek, például vas-szulfát, réz-szulfát, stb. vagy vitaminok, mint például B! vitamin, biotin stb. és más additívek is adagolhatok. Habzásgátló vagy felületaktív anyagok, például szilikon-olajok, polialkilén-glikol-éter stb. is hozzáadhatok a táptalajhoz. Természetesen egyéb szerves vagy szervetlen anyagok is adagolhatok alkalmas mennyiségben, amelyek elősegítik a mikroorganizmusok növekedését és növelik a G-6302 termelést. A G—6302 törzs tenyésztése az antibiotikum termelésnél általában szokásos körülmények között történhet, szilárd vagy folyékony halmazállapotú tenyésztési körülmények között. Folyadék tenyészet esetében a rendszer lehet stacionárius, vagy keverhetjük, rázhatjuk, illetőleg levegőztethetjük. A levegővel való keverés különösen előnyös lehet. A tenyésztés hőmérséklete cdszerűen 15-35 °C közötti, és a táptalaj pH-ját 4 és 8 közé cdszerű beállítani. A tenyésztést 8-168 óráig, cdszerűen 24-144 óráig folytatjuk. Tekintve, hogy a termelt G—6302 antibiotikum legnagyobb része a folyadék fázisban illetve a táp-levesben van jelen, célszerű a táp-leves szűrésével vagy centrifugálásával elkülöníteni a sejtek tömegétől, a szűrletben illetőleg a felül elhelyezkedő folyadékban található G—6302-t pedig megtisztítani. Adott esetben a tisztítás közvetlenül a táp-levesből is megoldható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
