178837. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izemeráz enzim előállítására
3 ÍÖOJ / 4 Nem hidxolizált kazein, zselatin, cellulóz, keményítő, apr: (V. B. D. Skermann, A Guide to the identification of the Genera of Bacteria, 2. kiadás, The Williams and Wilkins Book Co., Baltimore, 1967). 3-Ketoglikozidok termelése (M. J. Bernaerts, J. Deley, 1963, Nature 197, 406) Anilin kék-mannit-agar: növekedés színezék abszorpcióval (A.A. Hendrickson, J. L. Baldwin, A. J. Riker, 1934, J. Bact. 28, 597-618) Lakmusz-tej: szürkés-barna Szénhidrátok használata: oxidativ (R. Hugh, E. Leifson, 1953, J. Bact. 66, 24—26) A következő vegyületeket használjuk egyetlen szénforrásként a táptalajban végig, amelyeket R. Y. Stanier ír le (R. Y. Stanier és misai., 1966, J. Gén. Microbiol. 43, 159—271): D(+)glükóz, L(+)arabinóz, D(+)xilóz, D(+)trealóz, E>(—)ribóz, L(+)ramnóz, laktóz, cellobioz, maltóz, citrát, acetát, laktát, propionát, L-aszparaginsav, L-aszparagin, L-hisztidin-L-alanin, L-argjnin. Fertőzés sárgarépa gyökér szeleteken (J. A. Lippincott, B. B. Lippincott, 1969, J. Gen. Microbiol. 59,(1) 57-75). daganat gyökerek 1302 1303 1304 Ezeknek a jellemzőknek a Bergey’ s Manual of Determinative Bacterology, VIII. kiadás irodalmi helyen leírtakkal történő összehasonlításakor látjuk, hogy a találmány szerinti mikroorganizmusok a Rhizobiaceae családhoz, az Agrobacterium nemzetséghez, a tumefaciens fajhoz tartoznak. Az említett törzseket a Northern Regional Research Center of Peoria-ben (Illinois, Egyesült Államok) deponáltuk, ahol az NRRL B 11291 és NRRL B 11394 jelzéseket kapták. A mikroorganizmus tenyészeteket, amelyek szintén a találmány körébe tartoznak, aerob körülmények között valamely hagyományos módszerrel, például felületi tenyészetben vagy előnyösen süllyesztett tenyészetben készítjük, amelynek során keverős fermentorokat használunk. Valamely táptalaj, amely lehet szilárd vagy folyékony, tartalmaz egy asszimilálható szénforrást, foszforforrást, nitrogén- és ásványisóforrást. A tenyészetek 20 °C—40°C, előnyösen 25 °C-35 °C közötti hőmérsékleten 10^-8, előnyösen 20—30 óra alatt, 5,5—8,5 pH-tartományban, előnyösen 6,5-7,5 pH értéken fejlődnek. Szénforrásként glükózt, xilózt, laktózt, laktátot, acetátot, kukoricalekvárt és glicerint használhatunk. Nitrogénforrásként hús- és kazein-hidrolizátumot, szójabab-hidrolizátumot, ammóniumsókat, nitrátokat és karbamidot alkalmazhatunk. Megfelelő táptalaj például a következő összetételű lehet: glükóz 10 g/liter xilóz 5 g/liter kh2pq4 1 g/liter MgS04 • 7H20 1 g/liter NU, Cl 2 g/liter pH 7,0-7,2 A glükóz izomeráz extrahálását a baktériumtartalmú pasztából az enzimológiában szokásosan alkalmazott módszerekkel végezzük. Erre a célra a sejteket megfelelő készülékkel pusztítjuk el, például francia sejt nyomó sajtolóval, Manton Gaulin homogenizátorral, forgó aprítókkal, valamint ultrahangos készülékekkel. Az enzim kielégítően extrahálható mind acetonos porokból mind pedig fagyasztva számított készítményekből. A találmány tárgyát képezi a mikroba törzsekből nyert glükóz izomeráz, amelyet hővel szembeni stabilitás jellemez. A glükóz izomerizálását valamely hagyományos módszenei végezhetjük. A glükóz-oldatot közvetlenül hozzáadhatjuk valamely mikroorganizmus tenyészethez, azaz friss sejtekhez, de fagyasztott sejtekhez is, vagy acetonos porokhoz vagy fagyasztva szárított sejtekhez is. Hasonló módon használhatunk olyan készítményeket is, amelyek izomerázt tartalmaznak, így ezek kivonatait és koncentrátumait nyers vagy tisztított izomeráz készítményeket, továbbá azokat is, amelyeket a fenti mikroorganizmusokból kapunk. Végül műszaki és gazdasági előnyökhöz juthatunk azzal, hogy az enzimet rögzítjük, például olyan makromolekuláris vegyületekkel kombinálva, amelyek kémiai kötést létesítenek az enzimmel, esetleg ionos típusú kötést alakítunk ki vagy fizikai úton rögzítjük az enzimet. A következő példák a találmány szerinti eljárás részletes bemutatására szolgálnak, de a találmány nem korlátozódik csupán a példákban bemutatott módszerekre. 1. példa Egy táptalajt készítünk, amelynek az összetétele a következő: gükóz 5 g/liter xilóz 5 g/liter kh2po4 13 g/liter (NH4)2S04 2 g/liter MgS04 • 7H20 0,4 g/liter FeS04 • 7H20 10 mg/liter CaCl2 • 6H20 40 mg/liter MHS04 • 5H20 5 mg/liter ZnS04 • 7H20 5 mg/liter CuS04 • 5H20 1 mg/liter CoCI2 • 6H20 1 mg/liter A pH-t 7,2-re állítjuk be NaOH-dal és a táptalajt 100 ml-es adagokra osztjuk 500 ml-es Erlenmayer lombikokban. A táptalajt 30 percig 110°C-on sterilezzük, utána a lombikokat beoltjuk ugyanabból a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
