178837. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izemeráz enzim előállítására

178837 ,

5 6

táptalajból és 2% agart (DIFCO) tartalmazó ferde- Az így kapott acetonos por egy gramm mennyisé-tenyészetből származó NRRL B 11394 törzs-kultú- gének az aktivitása 2.200 egység, rával és keveréssel 220 ford/perc sebesség mellett 24 órán át inkubáljuk. A sejteket ezután összegyűjtjük centrifugálással, majd puffer-oldattal mossuk, amely 0,1 mól Na2S03-at, pH értéke 7, 1 • 10”4 mól Co++ és 5 • 10“3 mól Mg44 iont tartalmaz. Ilyen összetételű táptalaj 100 ml mennyiségéből 2 g nedves sejtet kapunk. Ezeket a sejteket a fenti puffer-oldat 20ml-ével iszapoljuk és a sejtszuszpenziót egy francia sejtnyomó sajtolóba visszük, ahol a sejtek elpusztulnak. Az így kapott kivonatban meghatározzuk az enzimaktivitást: 1 g nedves sejt 560 enzimegységet tartalmaz. Az enzimaktivitást a következő módon határozzuk meg:

Egy reakcióelegy, melynek összetétele a következő: 4,5 ml szubsztrát oldat 3,67 mól (D-glükóz), 5 • 10~3 mól, Mg++, 10'4 mól (V" és Na2S03= = 0,1 mól ionmentesített vízben, pH =7,0 0,5 ml nyers kivonatot adunk. Az inkubálást 2 órán át 60 °C-os vízfürdőn végezzük. Ezután a reakciót megszakítjuk oly módon, hogy az elegyet 0 °C-ra hűtjük. Ezután megmérjük a minta optikai forgatóképességét (a2 óra) ®s ez eredeti minta optikai forgatóképességét (a0) szobahőmérsékleten egy Perkin-Elmer polariméterrel (141 típus), Na-vonal (549 nanométer), a küvette optikai hossza: 0,1 dm.

Amennyiben a SNAMPROGETTI egységként határozzuk meg azt az enzimmenyiséget, amely 1 mg fruktózt termel 1 óra alatt a fenti kísérleti körülmények között, akkor az enzimegységeket egy gramm nedves sejtre vonatkoztatva a következő képlettel számíthatjuk ki:

Egységek

1 g nedves sejtre =

(a0 a2óra) ' glükózminta mg • 10

(agluk) (afrukt) ‘ 0,1 ’ C • 0,5'2

ahol

Kluk) = +54,16°

(«frukt) =-98,35°

C = glükóz-koncentráció g/ml oldat 0,1 = optikai hossz deciméterben (dm)

2. példa

NRRL B 11394 törzset tartalmazó táptalajokat készítünk az 1. példában megadott módon.

500 ml táptalajból 10,2 g nedves sejtet kapunk, amelyet 40 ml puffer-oldattal 0,1 mólos Na2S03, pH = 7 iszapolunk és a szuszpenziót keverés közben -10 °C-on 200 ml acetonhoz adjuk. 15 perces kezelés után a sejteket szűrőpapíron összegyűjtjük, acetonnal mossuk, összegyűjtjük és vákuumban szobahőmérsékleten szárítjuk. 1,9 g száraz sejtet nyerünk.

5 3. példa

Az NRRL B 11394 törzs sejtjeit készítjük el az 1. példában megadott módon és a 2. példa szerint acetonnal kezeljük.

10 Az acetonnal kezelt sejteket használjuk a glükóz izomer átalakulási százalékának a meghatározására az idő függvényében a reakcióelegyben.

A kísérleti körülmények a következők:

15 a) acetonnal kezelt sejtek: 10 g

b) szubsztrát térfogata: 1 liter

c) reakcióhőmérséklet: 60°C

A szubsztrát összetétele a következő:

2o 60% glükóz (súly/térfogat), Mg++: 5 millimól, Co++: 0,1 millimól, Na2S03: 100 millimól, pH = 7,0.

Az izomer átalakulás százalékos előrehaladása a következő:

Idő

(órában)

Átalakulás

(%-ban)

3

12,5

6

20,8

9

27,8

12

32,3

15

37,7

18

40,6

23

44,8

4. példa

NRRLB 11291 törzs tenyészetét és a megfelelő 40 sejtkivonatot állítunk elő az 1. példában megadott módon. 100 ml tenyészetből 1,72 g nedves sejtet kapunk.

A nedves sejtek aktivitása grammonként 412 egység.

45

Szabadalmi igénypont:

Eljárás glükóz izomeráz enzim előállítására, azzal 50 jellemezve, hogy Agrobacterium tumefaciens NRRL B 11 394 vagy Agrobacterium sp NRRLB 11291 mikroorganizmus törzseket asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajban levegőztetett, előnyösen süllyesz- 55 tett körülmények között, 20—40 °C hőmérsékleten és 5,5-8,5 pH tartományban tenyésztünk, majd kívánt esetben a kapott glükóz izomeráz enzimet kinyeijük a fermentléből.

A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 824658 - Zrínyi Nyomda, Budapest

3