178703. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható, étvágyszabályozó hatású frakció elkülönítésére állati vérszérumból
3 178703 4 átengedő membránszűrőn, a szűrletet bepároljuk, vízben oldjuk, az oldatot 50 000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 0,1 -1,0% nátrium-klorid-tartalmú vízzel eluálva frakcionáljuk, a biológiai aktivitást mutató frakciókat egyesítjük, bepároljuk, a szükséges mennyiségű vízben oldjuk, újból egy 50 000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú kromatográfiai gélre visszük, vízzel eluálva frakcionáljuk és a biológiai aktivitást mutató frakciókat bepároljuk, célszerűen liofilezzük. A találmány szerinti eljárás első lépése tehát az emberi és/vagy állati vérszérum ultraszűrése, 50 000 molekulasúlyig átengedő membránszűrőn keresztül, Ilyen membránszűrőként például Amicon UM 10 membrán, vagy más típusú Amicon vagy egyéb, például hasonló pórusméretű Sartorius membrán használható. Tapasztalataink szerint elsősorban az Amicon UM 05, UM 2, DM 5, UM 10, PM 10, UM 20, PM 30 és XM 30, valamint Sartorius 121 33, 121 34 vagy 121 36 membránok bizonyultak erre a célra alkalmasnak. A membránszűrést nyomás, célszerűen 3 atm nyomás alkalmazásával, állandó keverés közben végezzük. A membránszűréssel a szérumot két frakcióra bontjuk: a membrán pórusméreténél nagyobb molekulákat elkülöníljük a kisebbektől. Ennek során a találmány szerinti hatékony frakció, a szatietin, annak ellenére, hogy a szűrést 50 000 molekulasúlyig átengedőnek deklarált membránszűrővel végezzük és a szatietin - amint fentebb már említettük — 60 000 és 150 000 közötti molekulasúlyúnak mutatkozik, meglepő módon teljes mennyiségben a kismolekulájú, 10 000 körüli nagyságrendű molekulasúlyú anyagokat tartalmazó frakcióban jelenik meg. Az új hatásos frakció ilyen atipikus viselkedése, amely valószínűleg a membránszűrés során alkalmazott nyomás és keverés folytán válik lehetővé, a találmány szerinti eljárás szempontjából előnyös, mert megkönnyíti az új frakciónak az egyéb hasonlóan nagy molekulájú anyagoktól való elkülönítését, így tehát a kívánt hatékony frakció a membránszűrés szűrletében található, a vérszérum eredeti szárazanyag-tartalmához viszonyítva mintegy 10-20- szorosan bekoncentrálva, jóval kisebb molekulasúlyú kísérő anyagok társaságában. A találmány szerinti eljárás második lépéseként a membránszűréssel kapott szűrlet bepárlása útján nyert száraz maradékot desztillált vízben oldjuk és valamely 50 000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú kromatográfiai gélt tartalmazó oszlopra visszük. Kromatográfiai gélként elsősorban Sephadex G-15, továbbá például Sephadex G-10, G-25, G-50, G—75, vagy G-100, továbbá BioGelP—2, P-4,P-6, P—10, P—30, P—60 vagy P—100 alkalmazhatók jó eredménnyel. Az oszlopot célszerűen fiziológiás nátrium-klorid-oldattal vagy más, legalább 0,1% nátrium-kloridot vagy más, közel semleges pH-értéket biztosító sót tartalmazó oldattal eluáljuk. Az eluálás során a találmány szerinti új hatékony frakció a kizárási térfogatnál jelenik meg [ismeretes, hogy a gélkromatográfiás elválasztásoknál fontos jellemző a gél „kizárási térfogata”: mindazok a molekulák, melyek a gél szelektív elválasztási tartományának felső határa közelébe vagy ezen határ fölé esnek (a szelektív elválasztási tartomány felső határa például Sephadex G—15 esetében 1500), a kizárási térfogatnál, a gél-oszlop térfogatának 25—35%-át jelentős eluens térfogatnál eluálódnak], míg a membránszűrés után még jelenlevő kisebb molekulasúlyú kísérő anyagok legnagyobbrészt később, nagyobb elúciós térfogatnál mutatkoznak, több csúcsra szeparáló dva. A biológiai értékméréssel hatásosnak mutatkozó (a kontrolinál szignifikánsan hatásosabb) frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. Az így kapott, sokszorosan koncentráltabb hatóanyagtartalmú száraz maradékot a találmány szerinti eljárás harmadik lépéseként újbóli gélkromatográfiás frakcionálásnak vetjük alá, amelynek során már vízzel történő eluálással kapjuk a gyógyászati felhasználás céljaira alkalmas tisztaságú, hatásos terméket. Ezt a második gélkromatográfiás tisztítást ugyancsak 50 000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gélkromatográfiai oszlopon végezzük, az előző frakcionálási műveletből kapott száraz bepárlási maradékot a szükséges minimális mennyiségű desztillált vízben oldjuk és valamely alkalmas kromatográfiai géllel, például BioGel P-30 géllel töltött oszlopra visszük, majd az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk. A biológiai értékméréssel aktívnak mutatkozó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ezzel az eljárással általában már kielégítő tisztaságú termék alakjában kapjuk a hatékony frakciót, ha azonban a termék elektroforézises vizsgálata még valamilyen kísérő anyag jelenlétét mutatná, akkor ettől dietilamino-etil-cellulóz oszlopon történő kromatografálással mentesíthetjük a terméket. Ebből a célból az anyagot desztillált vizes oldatban visszük fel a dietilamino-etil-cellulóz oszlopra, majd az oszlopot desztillált vízzel mossuk, azután 0,1 n foszfát-pufferoldat (pH = 6,5) — 0,1 n foszfát-pufferoldat (ph = 6,5) +5%-os nátrium-klorid-oldat gradienssel eluáljuk. A tiszta szatietint a 0,1 n foszfát-pufferoldat (pH = 6,5) +0,5%-os nátrium-klorid eluálja az oszlopról, a tiszta szatietint tartalmazó eluátum-frakciót liofilizáljuk, majd BioGel P-30 gélen, desztillált vizes eluálással menetesítjük a hatóanyagot a szervetlen sóktól. A kapott tiszta szatietin homogenitását 15% aknl-amidot tartalmazó poli-akril-amid gélen történő elektroforézissel vizsgálhatjuk, pH = 4,5 pufféróldattal, 100V feszültség és csövenként 4 A áramerősség mellett. A találmány szerinti eljárással kapott új hatékony frakció, a szatietin, liofilizált állapotban hófehér, vattaszerű könnyű anyag, amelynek kémiai vizsgálata azt mutatja, hogy az anyag glikoproteid, amely savas hidrolízissel az aminosav- és cukor-komponensekre bontható. A humán vérsavóból nyert szatietin kémiai összetételének és szerkezetének felderítésére végzett vizsgálataink eddigi eredményei: A hidrolízistermék aminosav- és cukor-összetétele: A hidrolízises lebontási termékben kimutatható aminosavak: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
