178347. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok előállítására
3 178347 4 mus törzs új, és tiszta tenyészetként is jól nő folyékony táptalajon. Ennek megfelelően a találmány erre az új mikroorganizmusra, valamint a mikroorganizmusok termelésére szolgáló eljárásra is vonatkozik, mely anaerob körülmények között, folyékony asszimilálható nitrogénforrásokat és esszenciális ásványi sókat tartalmazó táptalajon, metángáz jelenlétében történik. Az eljárás magában foglalja a mikroorganizmusok kinyerését is a folyékony táptalajból. A Methylococcus 999 törzs jó növekedést mutat metánon, nem-metilotrófiás mikroorganizmusok jelenlétében is, anélkül, hogy metanolt hasznosító mikroorganizmusok jelen lennének. Ennek megfelelően a találmányban egy olyan eljárás is ismertetésre kerül mikroorganizmusok előállítására, melynek során a tenyésztést aerob körülmények között olyan folyékony táptalajon, mely asszimilálható nitrogénforrásokat, esszenciális ásványi sókat metángáz jelenlétében, valamint a Methylococcus 999 mikroorganizmus törzset (NCIB 11 083) egy vagy több olyan metilotrófiás mikroorganizmus jelenlétében, mely(ek) alkalmas(ak) a Methylococcus 999 (NCIB 11 083) által termelt anyagok mctabolizálására, tartalmaz. Ha karbamidot használunk nitrogénforrásként, a Methylococcus 999-et előnyösen valamely karbamát pozitív, nem-metilotrófiás mikroorganizmus jelenlétében termeljük. A T4 jelzésű vegyes kultúrát, mely különösen előnyösen alkalmazható a találmány szerinti eljárás során, trópusi kacsafarm iszap-mintájából izoláltuk. Az iszapminta 2 g-ját 250 ml-cs, 25 ml 1-NSM táptalajt (melyet a későbbiekben ismertetünk) tartalmazó rázólombikba visszük, és naponta kétszer 40% metánt és 50% levegőt, valamint 10" „ C02-ot tartalmazó gázkeveréket vezetünk bele. A lombikot 2,5 cm bolygós sugarú, 200 fordulattal forgó rázógépen, 40 C-on inkubáljuk egy héten át. A kultúrát, mely zavarossá vált, ugyanolyan rázólombikokba oltjuk át, aszeptikus körülmények között, 2 ml inokulumot használva. Ezt néhányszor megismételjük, és amikor jó növekedést tapasztalunk, a rázólombikban levő kultúrát az 1. példában ismertetésre kerülő körülmények között egy folyamatos kultúra inokulálásához használjuk fel. Miután a tenyésztést több mint 1000 órán keresztül folyamatos kultúrában végeztük, stabil, vegyes kultúrát kapunk, melyben a domináns mikroorganizmus egy kokkoid, metánt hasznosító baktérium. Az Így előállított vegyes kultúra (T4) jellemzőit a következőkben részletezzük : A metánt hasznosító mikroorganizmus tiszta kultúrájának izolálása a T4 vegyes kultúrából a szokásos agar lemezes technikával lehetetlennek bizonyul, mivel ezen a módon csak vegyes kolóniák alakulnak ki a lemezen. Mivel úgy tapasztaltuk, hogy amikor ezt a technikát alkalmazzuk, a metánt hasznosító mikroorganizmus növekedése a heterotrófiás (nem-metilotrófiás) baktériumok jelenlétének függvénye volt, a következő eljárás alkalmazását találtuk célravezetőnek: a T4 vegyes kultúra 1 ml-ét (körülbelül 2 g/lit) elkeverjük 1%-os Bacto Difco Agar 2—ASM táptalajjal készült (ismertetését lásd a későbbiekben)steril, megolvasztott szuszpenziójának 40 ml-ével, majd az elegyet steril Petri-csészékbc öntjük és állni hagyjuk. Ennek a tetejére egy második réteg agart öntünk, és egy steril Millipore membrán szűrőt helyezünk a második réteg tetejére. A T4 kultúra mintáit csíkokban felvisszük a membránra, majd 4 napig, 40 °C-on végzett inkubálás után megfigyeljük a kolóniákat. Azt találjuk, hogy ezek a Methylococcus 999 (NCIB 11 083) kokkoid, metánt hasznosító baktérium tiszta kolóniái. Ez az izolált organizmus csak akkor nő tiszta kultúraként, agar lemezeken, ha nagyon erős inokulumot használunk, vagy ha a fent ismertetett felülrétegzési technikát alkalmazzuk. Ezzel szemben a baktérium tiszta kultúraként is jó növekedést mutat folyékony táptalajban. A T4 kultúra a Methylococcus 999 (NCIB 11 083) metánt hasznosító törzset, egy metanolt hasznosító törzset (NCIB 11 112) és négy heterotróf törzset (NCIB 11 061, 11 062, 11 063, 11 065) tartalmaz. A metanolt hasznosító törzs, valamint a négy heterotróf törzs már ismertetésre került a 74 16644 számú holland szabadalmi bejelentésben. A metánt hasznosító mikroorganizmus a Methylococcus egy eddig még le nem írt speciesének mutatkozik a következő azonosítási adatok alapján. Membrán típus: párhuzamos halmazatokban elrendezett struktúra, melyet Whittenbury és mtsai írtak le a következő folyóiratban: Journal of General Microbiology (1970), 61, 205. Sejt alak : kokkusz Sejt átmérő: körülbelül 0,9 nm Növekedés 37 °C-on: + Növekedés 42 °C-on: + Növekedés 55 °C-on: Növekedés metano4-lon: + Növekedésgátló hatás a következő anyagok esetében: élesztőkivonat: — maláta : — acetát: — szukcinát : — Mozgékonyság : — Képződött kapszula: + Kolónia szín : barnásfehér Vízoldható pigment : — Gram-festés: Gram-variábilis, a Gram-festés változik a sejtek növekedési körülményeivel. A folyamatos tenyészetből összegyűjtött, nitrát táptalajon növekvő sejtek Grampozitívek, de az ammónián növekvő kultúrából kapott sejtek Gram-negatívak. Kataláz: + Oxidáz: + Glükóz sav: — OF (Hugh Leifson): nincs reakció Alkán oxidáció: + Érzékenység antibioa + jelzés érzékenységet jelent, tikumokra : a — jelzés azt mutatja, hogy nincs érzékenység. Klóramfenikol: 10 [Ag — Eritromicin: 10 [Ag -Szulfafurazol: 100 [Ag 4-Novobiocin: 5 [Ag -Oleandomicin: Penicillin G 1,5 egy5 [Ag -ségnyi: + 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
