178166. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunológiailag aktív poliribozil-ribotol-foszfát és az ezt tartalmazó oltóanyag előállítására
5 178166 6 A találmány szerinti eljárás azon a felismerésen alapszik, hogy a PRP poliszacharid a 20 mM foszfát-puffer tartalmú 6,7-6,9 pH-jú kálcium-foszfáton nem adszorbeálódik, adszorpció akkor sem lép fel, ha a foszfát-puífer (50 mM) pH-ja 5,8. Dyen 5 körülmények között azonban a szennyező anyagok (nukleinsavak, fehérjék, endotoxinok) adszorbeálódnak. A találmány szerinti eljárást szakaszosan vagy oszlopon végezhetjük. A szakaszos eljárásnál a részben tisztított PRP készítményhez (20 mM fősz-10 fát-oldatban, pH: 6,9) hidroxi-apatitot adunk. Az elegyet jól elkeverjük, centrifugáljuk, ily módon a nem kívánatos szilárd anyagokat elkülönítjük (pl. az adszorbens és az adszorbeált szennyező anyagokat). A felülúszó folyadékot az előzőek szerint 15 kezeljük, kétszer, az így kapott oldatot millipor szűrőn átszűrjük, pirogén-mentes desztillált vízzel dializáljuk, majd liofilizáijuk. Abban az esetben, ha a műveletet oszlopon 20 végezzük, a részben tisztított PRP-t 20 mM foszfát-puffer-oldatban (pH legalább 5,8), adszorbensként hidroxi-apatitot tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlop 20 mM foszfát-puffer-oldattal (pH: 5,8) kezeljük, majd 5,8 pH-jú 20mM-100mM nátrium-25 -foszfát-puffer-oldattal eluáljuk. A frakciókat felfogjuk és bennük a pentóz tartalmat meghatározzuk (poliribizol-ribitol-foszfát). A pentóz tartalmú frakciókat pirogén-mentes desztillált vízzel dializáljuk, majd liofilizáijuk. 30 II. Eljárás a b-típusú H. influenzáéból nyert PRP-t és pertussis antigéneket tartalmazó kombinált oltóanyag készítésére 35 A PRP oltóanyag készítésénél a fentiek szerint előállított liofilizált PRP-t 20 pg/ml koncentrációban foszfát-só-puffer-oldatban oldunk fel (0,113 g kálium-difoszfát, 0,83 g dinátrium-foszfát, 8,5 g nátrium-klorid/liter, pH: 7,0, az oldat 0,01% time- 40 rozált tartalmaz). Az oltóanyagot 0,45 p-os mülipor szűrőn sterilre szüljük, üvegampullába visszük, és 4 °C-on tároljuk, A PRP koncentrált oldalát oly módon állítjuk 45 elő, hogy meghatározott mennyiségű poliszacharidot lemérünk, és ezt foszfát-só-puffer-oldatban (0,113 g kálium-difoszfát, 0,083 g dinátrium-foszfát, 8,5 g nátrium-klorid/liter, pH: 7,0, 0,01% timerozál) oldjuk fel. Ezt a tömény PRP oldatot meg- 50 felelő mennyiségű friss B. pertussis sejt-szuszpenzióval elegyítjük, ily módon állítjuk elő az oltóanyaghoz szükséges alapoldatot. A 138 számú B. pertussis-törzs leírását az alábbi irodalom ismerteti: Bergey’s: Manual of Determinative bacteriology, 8. 55 (Bucharan and Gibbons Eds., Wms and Wilkins Co., Maryland, USA, 1964). A törzs beszerezhető az Egyesült Államok törzsgyűjteményében (Maryland, USA), letétszám: 10380. Az így elkészített oltóanyag alapoldatot 200 pg PRP-t és mintegy 60 70 opalizációs egység pertussis sejtet tartalmaz ml-ként. Az alapoldatot 4°C-on tartjuk 90 napig, amikor a pertussis antigének detoxifikációja végbemegy. Ezt követően elkészítjük az oltóanyagot, amely 10 p PRP-t és 3,5 op egység pertussis sejtet 65 tartalmaz 0,5 ml-ben. A találmány szerinti elárást az alábbi példák szemléltetik. 1. példa 2,5 g hidroxi-apatitot (például HTP biogélt, Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.) adunk 250 ml részben tisztított PRP készítményhez (az etanolos és cetavlonos kezelést követően), a PRP oldat hatóanyagtartalma mintegy 1,0 mg PRP/ml, az oldat 20 ml mM nátrium-foszfát-puffert tartalmaz (pH: 6,9). Az elegyet jeges fürdőben (l-4°C-on) 1 óra hosszat tartjuk, majd ezt követően 30 percig 16.000 percenkénti fordulatszámmal (Sorvall RC2-B) centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot ezt követően 0,65 p-os millipor szűrőn átbocsátjuk, majd az előbbi műveletet kétszer megismételjük, (minden alkalommal 2,5 g hidroxi-apatittal tisztítva az elegyet). Az így kapott oldatot 0,65 p és 0,45 p millipor szűrőn átbocsátjuk, majd pirogén-mentes desztillált vízzel dializáljuk és ezt követően Iiofllizáljuk. A liofilizált termék erős immunogén hatást mutat (Id. a továbbiakban a kombinált oltóanyaggal végzett állatkísérleteket). Az oltóanyag igen csekély szennyező anyagot tartalmaz (nukleinsavak, fehérjék, endotoxinok, ld. az 1. táblázatot). Ily módon mintegy 170 mg liofilizált PRP-t kapunk. A PRP-t a kiindulási poliszacharidhoz viszonyítva 70%-os hozammal kapjuk. A PRP tárolását megfelelő körülmények között, 4 °C-on foszfor-pentoxid és szilikagél tartalmú szárítószekrényben végezzük. 2. példa 300 mg részben tisztított PRP-t oldunk fel 100 ml 20 mM nátrium-foszfát-puffer-oldatban (pH: 5,8). Az oldat PRP-tartalma így 3 mg/ml. Az oldatot szobahőmérsékleten 5 x 45 cm méretű, körülbelül 250 ml térfogatú, hidroxi-apatitot tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot előzőleg 5,8 pH-jú 20 mM nátrium-foszfát-puffer-oldattal kezeljük, majd lépésenként 20 mM, 50 mM, 100 mM 5,8 pH-jú nátrium-foszfát-puffer-oldattal eluáljuk. Az egyes, 200 ml térfogatú frakciókat pentóz-tartalomra vizsgáljuk, majd a pentóz tartalmú frakciókat pirogén-mentes vízzel dializáljuk és liofilizáijuk. Mintegy 206 mg liofilizált PRP-t kapunk. A PRP poliszacharid tisztaságát nukleinsavakra, fehérjékre és endotoxinokra vizsgáljuk. A fehétje-tartalom meghatározását Lowry és társai: J. Bioi. Chem. 193:265, 1951) szerinti eljárással, szarvasmarha szérum albuminnal végezzük. A nukleinsav meghatározását 260 nm-en végezzük. 50 /ig nukleinsav ml koncentrációjú oldatot 1 cm-es rétegvastagságban vizsgálva, 1,0 abszorpciót mérhetünk. A molekulasúly meghatározást Sepharose 4B vagy 2B oszlopon gélfiltráció segítségével állapítjuk meg. A vizsgálathoz 1,5x90 cm méretű oszlopot (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) használunk. A megoszlási koefficiens (Kd) értékét a pentóz meghatározásnál mért vizsgálati eredmények alapján állapítjuk meg az eluált oldatrészekben. (Herbert és társai: Methods in Microbiology, 5B kötet, 285-291). 3
