178166. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunológiailag aktív poliribozil-ribotol-foszfát és az ezt tartalmazó oltóanyag előállítására
178166 7 8 1. táblázat A PRP fizikai-kémiai tulajdonságai Vizsgálat Endotoxin Eljárás Molekula méret Pentóz (%) Nukleinsav (%) Fehérje Pirogén vizs- Limulus lisát (Kd) (%) gálát vizsgálat d) nyúlon c) 1. példa 0* a) 36,0 0,8 0,7 10,0 1/400 2. példa 0,44b) c) d) 33,8 0,3 0,7 10,0 1/1000 a) Sepharose 2B és 4B oszlop alkalmazásával Ms > 2 • 107 b) Sepharose 4B-t alkalmazva c) Mg PRP/kg testsúly, (nyúl), amely még nem okoz lázat d) a PRP hígítás reciprok értéke (100 Mg PRP/ml), a Bureau of Biologies összehasonlító értéke (endotoxin standard) 1. példa a b-típusú Haemophilus influenzae-törzs jellemzőit írja le, beszerezhető az AEA mikroorganizmus gyűjteményében, Maryland, AEA, (letéti szám; 31551). 2. példa a b-típusú Haemophilus influenzae-törzs jellemzőit írja le, beszerezhető a Babies hosp., Columbia University, New York, AEA. 3. példa A b-típusú H. influenzae és a B. pertussis antigént tartalmazó kombinált oltóanyagot az alábbiak szerint állítjuk elő: 140 mg PRP-t a (a 2. példa szerint előállítva) oldunk fel 350 ml steril foszfát-só-puffer-oldatban (0,113 g kálium-difoszfát, 0,83 g dinátrium-foszfát és 85 g nátrium-klorid-tartalom/liter pH: 7,0, az oldat 0,01% timerozált tartalmaz). Az oldatot 0,45 m millipor szűrőn szűrjük át. Ezt a 400 Mg/ml PRP-t tartalmazó koncentrált oldatot használjuk fel a kombinált oltóanyag készítéséhez. A 400 Mg/ml koncentrációjú PRP oldatból 150ml-t kiveszünk, ehhez 150 ml friss B. pertussis sejt-szuszpenziót adunk (138-as törzs), a szuszpenzió pH-ja 7,0, az oldat zavarosságának értéke 149 opalizációs egység pertussis sejt/ml. Dy módon állítjuk elő a kombinált oltóanyag alap-oldatát. 300 ml alap-oldatot 4 °C-on tartjuk legalább 90 napig. Ez idő alatt a pertussis endotoxin színije lecsökken. Az alap-oldat sterilitását tioglikolát táptalajjal (32, 33 °C-on) vizsgáljuk. Az alap-oldat pH-ját a 90 napos inkubációs időt követően ellenőrizzük, majd 7,0 ±1 értékre beállítjuk. Az állatkísérletekhez felhasználandó oltóanyagot oly módon állítjuk elő, hogy az alap-oldatot foszfát-só-puffer-oldattal meghintjük, a meghígított oldat 10 Mg PRP-t és 3,5 op egység pertussis sejtet tartalmaz 0,5 ml-ként (1 dózis). A fentiek szerint előállított kombinált oltóanyaggal fiatal patkányokon antitest vizsgálatot végzünk, az eredményeket az 1. és 2. görbe tünteti fel. 4. példa A 400 Mg/ml PRP-t tartalmazó alap-oldatot oly módon állítjuk elő, hogy az 1. példa szerint előállí-25 tott PRP-ből 30mg-ot 75 ml steril foszfát-só-puffer-oldatban oldunk, majd az oldatot 0,45 m millipor szűrőn átszűrjük. Ebből az oldatból 25 ml-t 30 kiveszünk és ehhez azonos térfogatú, azaz 25 ml friss, B. pertussis sejtet tartalmazó, 7,0 pH-jú foszfát-só-puffer-oldatot adunk (138-as törzs, 149 op egység sejt/ml). Az ily módon előállított 50 ml alap-oldatot legalább 90 napig 4 °C-on tartjuk. Az 33 alap-oldat sterilitását tioglikolát táptalajban vizsgáljuk. Az alap-oldat pH-ja 7,0 ± 1. Ebből az alap-oldatból foszfát-só-puffer-oldat segítségével hígítást készítünk, a hígítás 10 Mg PRP-t és 3,7 op egység pertussis sejtet tartalmaz 0,5 ml-ben. Az ily módon 40 készített kombinált oltóanyagot állatkísérletekhez használj uk. 45 5. példa A 4. példa szerinti PRP alap-oldatot (200 Mg/nd» foszfát-só-puffer-oldatban, pH: 7,0) készítünk. A pertussis alap-oldatot (75 opalizációs egység/ml) 50 úgy állítjuk elő, hogy 25 ml friss B. pertussis sejt-szuszpenziót (149 opalizációs egység/ml) azonos térfogatú foszfát-só-puffer-oldattal hígítunk meg Mindkét oldatot egymástól függetlenül 90 napig, vagy ennél valamivel hosszabb ideig 4 °C-on inkubál- 55 juk. Az egyesített oltóanyagot oly módon állítjuk elő, hogy 14 ml PRP alap-oldatot (200 Mg/ml), valamint 14 ml detoxikált pertussis alap-oldatot (75 opalizációs egység/ml) egyesítünk, majd ehhez 112 ml foszfor-só-puffer-oldatot adunk. így 140 ml térfogatú 60 oldatot kapunk. A 0,5 ml-enként 10 Mg PRP ^ ^>' opalizációs egység pertussis oltóanyagot állatkísérletekhez használjuk. A fiatal patkányoknál mért antitest válasz 65 értékét a 3. ábra és a 2. táblázat tünteti fel. 4
