178166. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunológiailag aktív poliribozil-ribotol-foszfát és az ezt tartalmazó oltóanyag előállítására
3 178166 4 A találmány szerinti megoldás további célkitűzése, hogy PRP- és pertussis-oltóanyag kombinációjával olyan oltóanyagot állítson elő, amely fiatal állatoknál immunogén hatást fejt ki. I. A b-típusú Haemophilus influenzáéból kinyerhető poliribosil-ribitol-foszfát poliszacharid elkülönítése és tisztítása Mikroorganizmusok, táptalaj 10 Az eljáráshoz a b-típusú Haemophilus influenzae két törzsét használjuk fel. Az úgynevezett Rab-törzset Grace Leidy-től (Babies Hospital, Columbia University, New York City, New York) kaptuk. Az 14 15 úgynevezett CK-törzset egy betegnél izoláltuk (Waterbury Hospital, Waterbury, Connecticut). A mikroorganizmusokat egerekre többször átoltjuk, hogy virulenciájukat biztosítsuk. A mikroorganizmusokat ezt követően az állatok agyi szövetéből boncolási0 útján különítjük el, majd 3,7%-os Brain Heart infúziót (a továbbiakban: BHI, gyártó cég: Difco Lab., Detroit, Mich.) vagy 5%-os BHI agart tartalmazó 0,01%-os nikotin-amid-adenin-dinukleotidot (NAD, P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) és 1% 25 defibrinált ló-vért (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.) tartalmazó táptalajon tenyésztjük tovább. Ezt követően a kapott tenyészetből 1-1 ml-t ampullákba töltünk, liofilizáljuk, majd —70 °C-on tároljuk. 30 A mikroorganizmusok tenyésztésére táptalajként a 3,7%-os BHI táptalaj szolgál. Ehhez a táptalajhoz 10 mg NAD-ot és 20 mg hemint (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) adunk literenként. A csíra tenyészet 50 ml-éhez 1% (v/v) defibrinált ló-vért adunk. 35 Az adalék anyagokat frissen állítjuk elő és használat előtt 0,45 p Nalgen-szűrőn (Nalge Sybron Corp., Rochester, N Y.) szűrjük át. A mikroorganizmusokat 14 literes fermentorban szaporítjuk. A továbbiakban a táptalajhoz 0,5% glükózt adunk. 40 Az oltóanyag készítésénél 1 ml fagyasztott tenyészetet felolvasztunk, majd ezt 50 ml defibrinált ló-vérrel és NAD-dal dúsított BHI táptalajhoz viszszük. A tenyészetet 8 óra hosszat 37 °C-on szaporítjuk, miközben a tenyészetet 150 fordulat/perc 45 sebességgel rázatjuk. A mikroorganizmusokat 1%-os inokulumként adjuk a fenti segédanyagokkal dúsított BHI táptalaj 2 literes lombikban levő 500 ml-es adagjához, majd a 2 literes edényeket 32 °C-on mérsékelt rázás közben 8 óra hosszat (a 50 PRP izoláláshoz), vagy 14 óra hosszat (oltóanyag termeléshez) inkubáljuk. 14 literes iennentorba aszeptikus körülmények között 700 ml oltóanyagot viszünk, ezt 7 literre 55 BHI táptalajjal kiegészítjük (ez esetben a BHI defibrinált ló-vér helyett heminnel van dúsítva). Az elegyet 37 °C ±1 °C hőmérsékleten tartjuk. A fermentort 150 fordulat/perc sebességgel keverjük, az átbuborékoltatott levegő mennyisége 0,25 liter/li- 59 ter/perc. A fermentálás alatt 0,01% szilikon habzásgátlót (FD-82, Hodag Chemical Corp.) adunk az elegyhez. A tenyésztést a logaritmikus növekedés felső szakaszáig (8-10- 10" 9 sejtszám/ml), általában 8 óra hosszat folytatjuk: majd a mikroorganiz- 65 musok növekedését 0,4% formaldehid hozzáadásával leállítjuk és a fermentor tartalmát egy éjszakán át 4 °C-on tartjuk. Poliribizol-ribitol-foszfát elkülönítése A fentiek szerint előállított tenyészetet 4 °C hőmérsékleten 30 percig 27,000 percenkénti fordulatszámmal centrifugáljuk. A felül úszó sejteket elkülönítjük és az alábbiak szerint kezeljük. 1. lépés: csapadék képzése etanollal A felül úszó kultúrához annyi nátrium-acetátot adunk, hogy a végső koncentráció értéke 4% legyen, az oldat pH-ját 6,0-6,2 értékre állítjuk, majd 4 °C hőmérsékleten erőteljes keverés közben lassan 44 1 etanolt adunk hozzá. Az elegyet jégecettel 6,8 pH-értékre állítjuk be, majd 3 °C-on 12 óra hosszat állni hagyjuk. Az így keletkezett csapadékot dekantáljuk, majd centrifugáljuk. Ily módon nyers PRP terméket kapunk. 2. lépés: Cetavlon kezelés hexadeciltrimetil-ammóniumbromid) Az első lépésben kapott csapadékot pirogén-mentes desztillált vízben feloldjuk, majd az oldatot centrifugálva, a maradékot eltávolítjuk. A kapott tiszta, barna színű oldatot lassan, keverés közben 100 ml 10%-os cetavlon vizes oldatához adjuk (végső koncentráció 0,5%). Az elegyet 1 óra hosszat keveijük, majd centrifugáljuk. A nuklein-savakat és a PRP-cetavlon komplexet tartalmazó csapadékot 2 liter 0,3 M nátrium-kloriddal elegyítjük. A zavaros oldatot ezt követően centrifugáljuk, ily módon az oldhatatlan részeket, mint például a fehéije-cetavlonsót eltávolítjuk. A felül úszót ezt követően azonos mennyiségű vízzel meghígítjuk, ily módon a PRP-cetavlon-só kicsapódik. Az elegyet 1 óra hosszat keveijük, a csapadékot centrifugálással elkülönítjük, majd 2 liter 0,3 M nátrium-klorid-oldatban feloldjuk. 3. lépés: Etanolos csapadék A cetavlont és a nukleinsavakból és proteinből álló szennyezést ezt követően etanolos lecsapással eltávolítjuk (legalább kétszer megismételve). A PRP lecsapását az 1. lépésnél leírtak szerint végezzük, a cetavlont alkoholos oldatba visszük. A PRP-t centrifugálással kinyerjük, a liter pirogén-mentes desztillált vízben feloldjuk, majd a fentiek szerint eljárva újra kicsapjuk. A kapott PRP csapadékot 20 mM nátrium-foszfát-oldatban (pH: 6,8) szolubilizáljuk. 4. lépés: Hidroxi-apatitos kezelés A részben tisztított PRP terméket oly módon szabadítjuk meg a még jelenlevő szennyező anyagoktól (nukleinsavak, fehérjék, endotoxinok), hogy ezeket egy kálcium-foszfát tartalmú adszorbensen, mint például hidroxi-apatiton [3 • Ca3(P04)j ' * Ca(OH)í] adszorbeáltatjuk. 2
