178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
178052 32 Használat előtt minden oldószert vákuumdesztillációval hígítunk. Miután felvittük a mintát az oszlopra, kétszer 2 ml foszfát-puffért öntünk rá. Az oszlopot 5 °C-on 2 ml/perc sebességgel hívjuk elő. Az eluátumból 4 ml-es frakciókat fogunk fel. Miután a 100 ml után kapott eluált frakciókat 253ml-ig összegyűjtöttük, a frakciókat egyesítjük és vákuumban, 10 °C alatt, 6 ml-re töményítjük rotációs bepárlóval. Ezt a 436 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységet tartalmazó oldatot 1,7 cm átmérőjű oszlopra visszük fel, amely 90 ml előzetesen mosott XAD-2 gyantából áll (mint fent.) és amelyet előzőleg 5 °C-on desztillált vízzel egyensúlyba hoztunk. A minta után kétszer 2 ml desztillált vizet öltünk fel. Az oszlopot ezután desztillált vízzel" hívjuk elő 2 ml/perc sebességgel. Az eluátum 4 ml-es frakcióit fogjuk fel. Az eluátum 100-151 ml-e közötti frakciókat összegyűjtjük, a kapott folyadékot összeöitjük és rotációs bepárlóval 2,73 ml térfogatra koncentrájuk, majd az oldatot liofilizálva 6,49 mg tienamidnt kapunk. A 152 ml és a 345 ml között kapott frakciókat egyesítjük és rotációs bepárlóban 3,34 ml-re koncentráljuk, liofilizáljuk és ily módon 11,53 mg antibiotikumot kapunk. Ezek a frakciók 369 hidroxilamin-kioltási optikai sűrűség egységnek felelnek meg, ami 3,1-szerese az első XAD—2 gyanta-oszlopra (lásd fent) felvitt anyagnak és 31.000 egység/mg számított aktivitást jelent. E termék mintája spektrofotometriás elemzése szerint: Ej^m = = 253, foszfát-pufferban, pH = 7 értéknél, 297 nm-nél mérve. Hidroxilamin-kioltási abszorpció Az abszorpció 297 nm-nél mért hányadát - amely a szennyezett minták antibiotikum tartalmának tulajdonítható — az abszorpció szelektív extinkciójává határozzuk meg, amely híg hidroxilaminnal történő reakció esetén végbemegy (az antibiotikum egyidejűleg inaktiválódik). A mintákat 0,01 mólos kálium-foszfát-pufferban (pH = 7) állítjuk elő. A kezdeti 297 nm-nél mért abszorpció (A297) 0,05—2 közötti érték legyen. Annyi frissen készített [hidroxilamin-hidroklorid+ nátrium-hidroxid (végső pH = 7)] semleges hidroxilamint adagolunk, hogy a minta végső koncentrációja 10 millimól legyen. A reakciót szobahőmérsékleten legalább 30 percig hagyjuk lejátszódni. A kapott A297 értéket a (hozzáadott reagenssel történt hígításra korrigált) kezdeti leolvasási értékből kivonva, a hidroxilaminnal kioltható abszorpciót kapjuk. A tiszta tienamicin-oldatok 94,5%-os hidroxílaminnal kioltható abszorpciót mutatnak. 31 7. példa 99 g liofilizált szilárd termék lOg-ját, melyet a 6. példában leírt Dowex 1x2 gyantán (lásd a 6. 16 példát) történő tisztítással kapunk, 0,1 mólos 2.6- lutidin-acetát-pufferban (pH = 6,3) vesszük fel. A 125 ml oldatot ecetsavval pH = 6,3ra állítjuk be, az oldatot 7,6x142 cm méretű Dowex 50x8 2.6- lutidin-ciklusú polisztirol-divinilbenzol-alapú gyanta-oszlopra visszük fel, az oszlopot előzőleg a puffénál egyensúlyba hozzuk. Az oszlopot 0,1 mólos fenti pufferral hívjuk elő 35 ml/perc sebességgel. Egy 3,6 literes előfrakdót fogunk fel, melyet 200, egyenként 20 ml-es frakció követ. A 6—194. frakciók közül 1 :200 hígításban minden negyedik frakciót megvizsgálunk. Bioaktivitást a 18—178. frakció mutat, a maximum a 62-82. frakcióban jelentkezik. A 42—102. frakciót egyesítjük és 640 ml ionmentes víz hozzáadásával 1920 ml oldatot kapunk. Az egyesített hígított oldatot, amely a fenti Dowex 50 x 8 oszlopra felvitt oldat bioaktív anyagának 63%-át tartalmazza, liofilizáljuk. A liofilizált szilárd anyagot 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetátban oldjuk fel (pH = 7). A kapott 25 ml oldatot 5 x 112 cm Bio-Gel P—2 poliakrilamid-alapú oszlopra (200-400 „mesh” szemcseméretű) visszük fel, az oszlopot előzőleg 0,1 mólos fenti pufferral egyensúlyba hozzuk. A gél-oszlopot ugyanezzel a pufferral hívjuk elő 10 ml/perc sebességgel. A kiáramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű regisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Az előhívat addig folytatjuk, ameddig 125, egyenként 20 ml-es frakciót összegyűjtünk. A 70-89. frakciók mindegyikét 1 :300 hígításban vizsgáljuk. A 72-81. frakciók a bioaktívak, a bioaktivitás a 77. frakcióban éri el a maximumot. A 75—79. frakciót liofilizáljuk, és 100,5mg 8320 egység/mg aktivitású antibiotikumot kapunk. A 100,5 mg liofilizált szilárd anyagot 4 ml pH = 7 értékű, 0,01 mólos kálium-foszfát-pufferben vesszük fel. Ezt az oldat 692 hidroxilamin-kioltási abszorpció-egységnek felel meg. Az oldatot 1,7 cm átmérőjű, 90 ml, előzetesen mosott és 0,1 mólos fenti pufferrel egyensúlyba hozott XAD—2 gyantával (1. a 6. példát) töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot használat előtt pH = 7 értéken és 5 °C-on 180 ml 0,01 mólos kálium-foszfát-pufferral egyensúlyba hoztuk. A XAD—2 fenti gyanta mosását használat előtt a következőképpen végeztük: 5 térfogat 1 n nátrium-hidroxid-oldattal, majd ionmentes vízzel, ameddig a kifolyó anyag semleges lesz, majd 5 térfogat 1 n sósav-oldattá, majd ionmentes vízzel, ameddig a kifolyó anyag semleges lesz, azután 5 térfogat metanollá, ace ionná, 0,001 mólos (etilén-diamin)-tetraecetsav-tetranátriumsóval, végül desztillát vízzel. Használat előtt váamennyi oldószert vákuumdesztülációvá tisztítjuk. Miután a mintát felvittük az ioncserélő-oszlopra, 2x2ml foszfát-puffért viszünk rá. Az oszlopot a pufferrel 5 °C-on, 2 ml/perc áramlási sebességgel előhívjuk. Az eluátum 4 ml-es frakcióit összegyűjtjük. A frakciókat 109-309 m!-ig összegyűjtjük és egyesítjük. Ehhez az egyesített eluátumhoz adjuk a 6. példában kapott XAD-2 gyanta-oszlopon tisztított 11,53 mg antibiotikumot, amely 186 hidroxilamin-kioltási optiká sűrűség egységű. Az egyesített eluátumot a hozzáadott antibiotikummá együtt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
