178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
29 178052 30 zásgátlót adunk hozzá, 0,1%-ot nem meghaladó mennyiségben. A vizsgálatnál a centrifugált fermentlé felülúszó rétegét használjuk. Az eredményeket a következő táblázat foglalja össze: « a EB o, N 'Q ! o w CO C Sí er, S M "-O ? a •2'áo § gsaa a-*SpH H N fi 2 § ft .2 -B 9 » SS ° s I 0 6,6 22,2 12 6,3 20,2 24 5,8 18,0 0 36 6,0 13,2 21,5 48 6,0 8,6 21,5 60 5.7 6.4 26,5 72 5,8 2,7 25,5 84 6,2 0,3 27,5 96 6,4 0,2 36,0 108 6,4 0 35,0 120 6,3 41,5 37,0 132 5,8 37,5 144 5,9 43,0 37,5 A vizsgálatot agar-diffúziós módszerrel végezzük, 9,5 mm-es szűrőpapír lemezeket és 10 ml-es lemez-tenyészeíeket használunk és az eredményeket a fenti táblázat tartalmazza. A lQml-es lemez-tenyészeteket a következő módon állítjuk elő: 0,2% élesztő-kivonatot tartalmazó táptalajban levő Staphylococcus aureus egy éjszakán át kialakult növekményét 0,2% élesztő-kivonatot tartalmazó táptalajjal hígítjuk, és így egy 660 mp hullámhosszon 40%-os fényáteresztőképességű szuszpenzióhoz jutunk. Ezt a szüszpenziót 2 g/liter (Difco) élesztő-kivonattal kiegészített (Difco) tápagarhoz adjuk 47—48 °C-on és ily módon 33,2 ml szuszpenzió/agar liter koncentrációjú készítményt kapunk. A szuszpenzió 10ml-ét 85 mm átmérőjű Petri-csészékbe öntjük, a csészéket lehűtjük, és a felhasználás időpontjáig (maximum 5 napig) 4 °C-on tartjuk. 4,082 liter fermentlevet 762 mm-es présszűrőn leszűrünk és 4 súly/térfogat% mennyiségben szűrési segédanyagot használunk. A szűrlethez 12 g (etilén-diamin)-tetraecetsav-tetranátriumsót adunk. A szűrletet 6°C-ra hűtjük, és a pH-t 4,5±0,2-re állítjuk be, miközben a hőmérsékletet 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 480 liter Dowex 50 x 4, nátrium-ion-cildusú (20-50 „mesh” szemcseméretű) polisztirol-divinilbenzol-alapú ioncserélő gyantán 48 liter/perc sebességgel adszorbeáltatjuk. Az adszorbeátumot 480 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 2%-os vizes piridinnel eluáljuk 24 liter/perc sebességgel. 300 liter, 520 liter és 240 liter térfogatú frakciókat fogunk fel és pK = 7 értéken vizsgáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy az eluált frakciók 4%, 16% és 6%-át tartalmazzák a fenti Dowex ioncserélő oszlopra felvitt összes bioaktiv anyagnak. A 2-es eluált frakciót 48 literre töményítjük, a pH-t előbb 7-re, majd 7,3-ra állítjuk be és 76liter Dowex 1x2 (50-100 „mesh” szemcseméretű) klorid-ion-ciklusú polisztirol-divinilbenzol-alapú gyantán adszorbeáltatjuk 7,6 liter/perc sebességgel. A gyantát ionmentes vízzel eluáljuk azonos sebességgel. Négy frakciót fogunk fel, kettő térfogata 48 liter, egyé 70 liter és egyé 48 liter A frakciók pH-ját 7-re állítjuk be. A vizsgálati ered- 5 mények szerint a kezdeti bioaktivitás 68%-a a 70 literes frakcióban észlelhető. Ezt a frakciót 18 literre koncentráljuk pH = 7 értéken, majd 0,45 mikronos „Millipore” szűrőn leszűrjük. A szűrletet tálcán liofilizáljuk, és ily módon 99 g 310egység/mg 10 aktivitású terméket kapunk. A liofilizált szilárd anyagból lOg-t, 0,1 mólos 2.6- lutidin-acetát-pufferben veszünk fel, melynek pH-ja 6,3. Az így kapott 125 ml oldat pH-ját ecetsav hozzáadásával újra beálllítjuk 6,3-ra és fel-15 visszük egy Dowex 50 x 8 (200-400 „mesh” szemcseméretű) 2,6-lutidin-ciklusú 7,6 x 142 cm-es polisztirol-divinilbenzol-alapú gyanta-oszlopra, melyet előzőleg pufferral egyensúlyba hoztunk, és 0,1 mólos fenti pufferral hívjuk elő 25 ml/perc sebes- 20 séggel. Egy 3 literes előfrakciót fogunk fel, majd ezt 200, egyenként 20 ml-es frakció követi. A 36-192. frakciók közül minden negyediket vizsgáljuk 1 :200 hígításban. Az 56-192. frakciók a bioaktí- 25 vak, a maximum a 92-96. frakciókra esik. A 80-136. frakciót egyesítjük, 590 ml ionmentes vizet öntünk hozzá, és ily módon 1760 ml oldatot kapunk. Az összeöntött, hígított oldat a fenti Dowex 50x8 ioncserélő-oszlopra felvitt bioaktiv 30 anyag 62%-át tartalmazza. Ezt az oldatot Eoíüizáliuk. A liofilizált szilárd anyagot 0,1 mólos 7-es pH-jú 2.6- lutidin-acetát puffeiben feloldjuk. A 27 ml oldatot Bio-Gel P—2 (200-400 „mesh” szemcsemé-35 retű) 5x112 cm-es poliakrilamid-oszlopra visszük fel, melyet előzőleg 0,1 mólos fenti pufferral egyensúlyba hoztunk. A gél-oszlopot ugyanezzel a pufferral hívjuk elő 10 ml/perc sebességgel. A-4aáramló folyadékot „Mecce-matic” elnevezésű re- 40 gisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Az előhívást addig folytatjuk, amíg 105, egyenként 20 ml-es frakciót fogunk fel. A 70-93 frakciók mindegyikét vizsgáljuk 1 :300 hígításban. A 73-82. frakciók a bioaktívak, a maximum a 77 45 és a 78. frakciókban jelentkeznek. A 75-80. frakciót liofilizáljuk és 90 mg 10.000 egység/mg aktivitási átlagú antibiotikumot kapunk. A 90 mg liofilizált szilárd anyagot 4 ml 0,01 mólos kálium-foszfát pufferben (pH = 7) vesz- 50 szűk fel. Az 596 hidroxilamin-kioltás-abszorpciójú (optikai sűrűség) egységet tartalmazó oldatot pH = 7 értéken, 5 °C-on (a tienamicin tartalom mérését a példa végén újuk le) 1,7 cm átmérőjű, 90 ml, előzetesen mosott XAD-2 polisztirol-divinilbenzol- 55 -alapú gyantára visszük fel, melyet előzőleg 180 ml 0,01 M kálium-foszfát pufferte! egyensúlyba noz tunk. A XAD-2 fenti gyantát használat előtt egymás után a következő folyadékokkal mossuk: 5 térfogat 1 n nátrium-hidroxid-oldattal, majd ion- 60 mentes vízzel, amíg a kifolyó anyag semleges lesz, ezután 5 térfogat 1 n sósav-oldattal és ionmentes vízzel, amíg a kifolyó anyag semleges lesz, 5 térfogatnyi metanollal, acetonnal, 0,001 mólos eiilén-diamin-tetraecetsav-tetranátriumsóval, végül desz- 65 tfllált vízzel. 1
