178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
178052 27 28 második frakciót megvizsgálunk. A 76—148. frakciókban egyetlen bioaktív csúcsot észlelünk, melynek maximuma a 92—102. frakcióknál jelentkezik. A 86—113. frakciókat összeöntjük és 580 ml oldatot kapunk, amely a Dowex 50 x 8 polisztirol-dM- S benzol-gyanta oszlopra felvitt anyag bioaktivitásának 71%-át tartalmazza. Ezt az oldatot iiofilizáljuk. A kapott liofllizált szilárd anyagot 0,1 mólos 7-es pH-jú 2,6-lutidin-acetát pufferben feloldjuk és így 25 ml oldatot kapunk. Ezt az oldatot előzőleg 10 0,1 mólos pufferral egyensúlyba hozott 5 x 108 cm méretű Bio-Gel P—2 (200-400 „mesh” szemcseméretű) poliakrilamid-oszlopra visszük fel. A gél-oszlopot ugyanezzel a pufferrel hívjuk elő 9 ml/perc sebességgel. A kiáramló folyadékot 15 „Mecco-matic” regisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Az előhívást addig folytatjuk, ameddig 105, egyenként 20 ml-es frakciót összegyűjtünk. A 65-80. frakciók mindegyikét 1 :200 hígításban megvizsgáljuk. A bioaktív csúcs a 20 67—76. frakcióknál figyelhető meg. A 70—72. frakciót egyesítjük, Iiofilizáljuk és így 16,0 mg 13800 egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. A 69. 73. és 74. frakciókat egyesítjük, Iiofilizáljuk és ily módon 20,2 mg 5.200 egység/mg aktivitású anyagot 25 kapunk. A liofllizált szilárd anyag 16 mg-ját 0,1 mólos 7-es pH-jú 2,6-lutidin-acetát pufferben feloldjuk és így 10 ml oldatot kapunk. Az oldatot 5 x 108 cm méretű Biol-Gel P-2 (200-400 „mesh” szemcse- 30 méretű) poliakrilamid-oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg ugyanezzel a pufferrel egyensúlyba hozunk. A gél-oszlopot 9 ml/perc sebességgel az említett pufferrel előhívjuk. A kiáramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű regisztráló differenciál 35 refraktométerrel nyomon követjük. Az előhívást addig folytatjuk, amíg 105, egyenként 20 ml-es frakciót összegyűjtünk. A 65-80. frakciók mindegyikét 1 :200 hígításban vizsgáljuk. A 67—75. frakcióknál figyeljük meg a bioaktív 40 csúcsot. A 68—72. frakciókat egyesítjük, liofilizáljuk és így 9,1 mg 15.000 egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml A/ beoltott tenyészetet tartalmazó lombikot 28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú (5,08 cm löket) rázóberendezésben 48 óra hosszat rázzuk. A 48 óra múlva kapott fermentléből 40ml-t aszeptikusán elkülönítünk és 40 ml steril 20 térfogat%-os glicerinnel összekeverjük. A kapott elegy 2 ml-ét steril 1,772 g-os ampullákba pipettázzuk, megfagyasztjuk és cseppfolyós nitrogénnel működő hűtőgépben gőzfázisú nitrogénben tároljuk. 50 ml A táptalajt tartalmazó 250 milliliteres Erlenmeyer-lombikot beoltunk egy ampulla megfagyott tartalmával. Ezt az. inokulunr lombikot 28 °C-on 24 óra hosszat rázatjuk 160 percenkénti fordulatszámú rázógépben. A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikból 10 ml-es adagokkal beoltunk 500 ml A táptalajt tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikokat. Ezeket az inokulum lombikokat 160 percenkénti fordulatszámú rázóberendezésben 24 óra hosszat rázzuk 28 °C-on. A lombikok egyesített tartalmának 1000 ml-ével beoltunk egy 467 liter A táptalajt tartalmazó 756 literes rozsdamentes acél fermentort. Ezt a tartályt 28 °C-on 130 percenkénti fordulatszámmal és 4.7 liter/másodperc levegőáramoltatási sebességgel kevertetjük. Kívánt esetben Polyglycol 2000-t használunk habzásgátlóként, 0,1%-nál nem nagyobb mennyiségben (Dow Chemical Corp.). A mért pH-értékeket és a dextróz mennyiségét a következő táblázat tartalmazza: Tenyésztési idő (óra) 0 12 24 pH 6,4 6,4 6,6 dextróz mg/ml 8,1 8,1 8,1 A kapott tenyészet- 453 literével beoltunk egy 4082 liter E táptalajt tartalmazó 5670 literes rozsdamentes acél fermentort. Az E táptalaj összetétele a következő: 6. példa E táptalaj Egy, a Streptomyces cattleya törzs liofllizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és tartalmát 50 ml steril A közeget tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban szuszpendáljuk. Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj áesztő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer oldat 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml >H: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. :Ardamine: a Yeast Products Corporation terméke keményítőcukor 50 kukorica-lekvár desztillációs maradék gyapotmag közeg (Pharm amedia) kobalt-klorid-hexahidrát 55 kalcium-karbonát (pH beállítás után) Polyglycol 2000 csapvíz 25.0 g 15.0 g 10.0 g 5.0 g 0,01g 3.0 g 0,25 térfogati 1000 ml 60 pH: nátrium-hidroxiddal 7,3-ra állítjuk be. Ezt a tartályt 24 °C-on 70 percenkénti fordulatszámú keverési sebességgel és 25,5 liter/másodperc levegőáramoltatási sebességgel 144 órán keresztül 65 kevertetjük. Kívánt esetben Polyglycol 2000 hab-14
