178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
25 17*052 26 A táptalaj élesztő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer oldat 2,0 ml magnézium-szulfát-he ptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml xArdamine: a Yeast Products Corporation terméke Foszfát-puffer oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g dinátrium-hidiogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml A beoltott ferde tenyészeteket 1 hétig inkubáljuk 28 °C-on, majd 4 °C-on tároljuk. Az A táptalaj 10iri-ét aszeptikusán az egyik ilyen ferde tenyészetet tartalmazó kémcsőbe átvisszük, a spórákat és a légmicéliumokat szuszpendáljuk és a szuszpenzió 3,3nú-ével 500 ml A táptalajt tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikot oltunk be. Ezt az inokulum lombikot 28 °C-on 160 percenkénti fordulatszámú, 5,08 löketű rázógépen 48 óráig rázatjuk, mely idő múlva megfelelő növekedést érünk el. E tenyészetet arra használjuk, hogy egy 160 liter A táptalajt tartalmazó 190 literes rozsdamentes acéltartályt beoltsunk. Ezt a tartályt 28°C-on kevertetjük. A keverési sebesség 150 fordulat/perc, időtartama 24 óra, a levegő áramlási sebessége 1,41 liter/másodperc. Kívánt esetben Polyglycol 2000 (Dow Chemical Corp.) habzásgátlót használunk 0,1%-ot meg nem haladó mennyiségben. A pH-meghatározás eredményei a következők: Tenyésztési idő (óra) 0 12 24 pH 6,3 6,6 5,6 Ebből a tartályból a tenyészet 35 literével beoltunk .467 liter E táptalajt tartalmazó 756 literes rozsdamentes acél fermentort. Az E táptalaj összetétele a következő: E táptalaj keményítőcukor 25,0 g kukorica-lekvár 15,0 g desztillációs maradék 10,0 g gyapotmag közeg (Pharmamedia) 5,0 g kobalt-klorid-hexahidrát 0,01 g kalcium-karbonát (pH beállítás után) 3,0 g kalcium-karbonát Pblyglycol 2000 0,25 térfogat% csapvíz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddál 7,3-ra állítjuk be. Ezt a tartályt 24°C-on, 95 fordulat/perc keverési sebességgel, 4,7 liter/másodperc levegőáramlási sebességgel, 120 óra hosszat kevejjük. Kívánt esetben 0,1%-ot meg nem haladó mennyiségű Polyglycol 2000 habzásgátló adalékot adunk hozzá. Vizsgálatokat folytatunk az eredményeket a következő táblázat tartalmazza: 5 Tenyésztési idő (óra) pH Antibiotikus aktivitás (ATCC 6538 P-vel szemben) mm 0 6,9 10 12 6,8 ___________ 24 6,3 — 36 6,4 26 48 6,3 32 60 6,4 25 15 72 6,8 25 84 7,0 25 96 7,1 37 108 7,2-41,5 120 7,1 44,5 20 Az egész lé 400 literét présszűrő és legfeljebb 4 súly/térfogat%-nyi szűrési segédanyag felhasználásával leszűrjük. 1,2 g (etÜén-diamin)-tetraecetsav-tetranátriumsót adunk a szűrlethez. A szűrletet 25 6 °C-ra hűtjük, a pH-t 4,0 ± 0,2 értékre állítjuk be és 6°C-on tartjuk. A hideg szűrletet 38 liter Dowex 50x4, nátrium-ion-ciklusú (20-50 „mesh”) szemcseméretű polisztirol-divinilbenzol-alapú gyantán 41iter/perc sebességgel adszorbeáltatjuk. Az ad- 30 szorbeátumot 2%-os vizes piridinnel eluáljuk és 3, egyenként 19 literes frakciót gyűjtünk össze, melyeket megvizsgálunk. A vizsgálatok azt mutatják, hogy bioaktív anyag 27%-a a 2-es és 3-as frakciókban jelentkezik. A 2-es és 3-as eluált frakciókat 35 összeöntjük, térfogatukat 3,7 literre koncentráljuk és a pH-értéket 7-re állítjuk be. A 3,7 liter eluált koncentrátumot pH = 7,4-re állítjuk be és 7,5 liter Dowex 1 x 2,klorid-ion-ciklusú (50-100 „mesh”) szemcseméretű polisztirol-divi- 40 nilbenzol-gyantán 200ml/perc sebességgel adszorbeáltatjuk. Ezután a gyantát azonos sebességei ionmentes vízzel eluáljuk. 2x2 literes, 1 x 800 ml-es, 1x4 literes és 1x2 literes frakciókat fogunk fel és kívánt esetben 45 a pH-t 7-re állítjuk be. A 4 liter térfogatú 4-es frakciót, amely a koncentrátumban jelen levő aktív anyag 50%-át tartalmazza, 0,45 mikronos „Millipore” szűrőn leszűrjük. A tiszta szűrletet tálcán liofilizáljuk és ily módon 12,4 g 270 egység/mg 50 aktivitású szilárd anyagot kapunk. A liofilizált szilárd anyag 4 grammját 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-puffeiben (pH = 6,3) vesszük fel. 50 ml oldatot, melynek pH-ját ecetsav hozzáadásával 6,3-ra állítjuk vissza, 2,6-lutidin-ciklusú Dowex 50 x 8, 5 x 14 cm 55 méretű (200—400 „mesh” szemcseméretű) polisztirol-divinilbenzol-gyanta oszlopra visszük fel, az oszlopot előzőleg 0,1 mólos pufferrel egyensúlyba hozzuk. A gyantát ezután ugyanezzel a 0,1 mólos 6,4 pH-jú pufferrel hívjuk elő 14ml/perc sebesség- 60 gél. A kiáramló folyadékot „Mecco-matic” elnevezésű regisztráló differenciál refraktométerrel nyomon követjük. Az előhívást addig folytatjuk, amíg 150, egyenként 20 ml-es frakciót összegyűjtünk. A 65 72-150. frakciók közül 1 :50 hígításban, minden 13
