177992. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált 2,3-dihidro-imidazo[1,2-c]pirimidin-származékok előállítására
13 177992 14 Egy második tesztet is végeztünk az I típusú Herpes simplex vírussal, és a II típusú Herpes simplex vírussal szemben, melynek kivitelezése a következőképpen történt. Tengeri malacokat intravaginálisan inokuláltuk úgy, hogy a vaginát 2 x 104 folt-egységnyi (plaque forming unit) vírust tartalmazó higroszkópos vatta-csomóval tamponáltuk. A vírussal történő inokuláció előtt a vaginát fiziológiás sóoldatot tartalmazó vattával tamponáltuk azért, hogy a potenciális vírusinhibitorokat eltávolítsuk. A kezelést az inokuláció után négy nappal kezdtük, és további négy napon át folytattuk. A gyógyszert is egy megfelelő vivőanyagban higroszkópos tampon segítségével vittük be a vaginába. A kontroll állatokat csak a vivőanyagot tartalmazó vattával tamponáltuk. Az állatok megfigyelését az inokuláció utáni 5. napon kezdtük, és a 10. napig folytattuk, mely megfigyeléseket 0-tól 4+-ig jelöltük vagyis a váladékképződést, gyulladást, hólyagosodást és a szövet elhalását (üszkösödését), így minden tengeri malacnál a jelek lehetséges felső határa +16. Ezeket az eredményeket a II. táblázatban összegeztük. A táblázatban az első oszlop a gyógyszer hatóanyagát, a második a közeget, a harmadik a koncentrációt, a negyedik a kísérletnél felhasznált állatok számát és az ötödik oszlop a végeredményt tartalmazza. A találmány szerinti vegyületek a Herpes simplex vírus ellen in vitro alkalmazva is mutatnak vírus-elleni aktivitást. Az ilyen típusú aktivitás bizonyítása céljából a következő tesztet végeztük. Afrikai kabócamajom vese-sejteket (BSC-1) vagy Hela-sejteket 25 cc. Falcon edényben, 37 °C hőmérsékleten, 199-es közegben, mely 5% fötális bovin-szérumot (FBS), penicillint (150 egység/ml) és streptomicint (150mg/ml) tartalmazott, tenyésztettünk. Mikor összefolyó monorétegek alakultak ki, a szupematáns növekedési közeget eltávolítottuk, és minden edényhez a Herpes simplex vírusnak egy megfelelően híg oldatából 0,3 ml-t adtunk. Szobahőmérsékleten az adszorpció egy óra alatt végbement, ezután a vírussal fertőzött sejtréteget befedtük egy közeggel, mely egy rész 1%-os 2 számú Ionagart és FCS-sel (fötális bojjúszérummal), penicillinnel és sztreptomicinnel együtt egy rész dupla erősségű 199-es közeget, valamint 100, 50, 25, 12, 6 és 3 mikrogramm/ml (mcg/ml) koncentrációjú gyógyszert is tartalmazott. A kontroll edény nem tartalmazott gyógyszert. A törzsoldat 104 mcg/ml koncentrációjú 2,3-dihidro-imidazo[l,2-c]pirimidin-vegyületek dimetÜszulfoxidos oldata volt. Az edényeket 37 °C hőmérsékleten, 72 órán át inkubáltuk. Azokon a területeken, ahol a vírus megfertőzte a sejteket, és a sejtekben szaporodott, foltok megjelenését tapasztaltuk. Minden edényhez 10% formaiint és 2% nátriumacetátot tartalmazó oldatot adtunk, hogy a vírust inaktiváljuk, és a sejtréteget az edény falán fixáljuk. A vírusfoltokat a mérettől függetlenül megszámoltuk, miután a keretezett sejtterületeket kristályibolyává megfestettük. A foltok számát minden gyógyszer-koncentrációnál összehasonlítottuk a kontroll foltok számává, és a tesztvegyület aktivitását a foltok gátlásának mértékével (%-os) fejeztük ki. A in. táblázatban ezeket az eredményeket összegeztük úgy, hogy az első oszlop a hatóanyag nevét, és a 2-6. oszlop a különböző mcg/ml koncentrációjú gyógyszeradagolás esetén tapasztát herpes simplex foltok gátlását (%-ban kifejezve) tartámazza. A fenti táblázat adataiból kitűnik, hogy azok az I áltáános képletű vegyületek, melyeknél R* 1 jelentése klóratom, a táálmány szerinti vegyületek egy előnyös csoportját ákotják, és azok az I átáános képletű vegyületek, melyeknél R1 jelentése klóratom és R jelentése váamely 1-5 szénatomos ákil- vagy metilmerkapto-csoport, a szóban forgó vegyületeknek egy különösen előnyös csoportját ákotják. A táámányhoz tartozó I átáános képletű vegyületek meg tudják gátolni a Herpes simplex vírus növekedését azokon a felületeken, ahol a szóban forgó vírus egyébként szaporodna. Ilyen felületek lehetnek példáá bizonyos tárgyak, így kórházi üvegáruk, kórházi dolgozó felületek és hasonlók. A vegyületeket hatóanyagként tartámazó készítmények emlősöknél helyileg, bőrfelületek kezelésére és különösen a szájüregben és a vaginában jelenlevő nyákahártyák kezelésére is ákalmazhatók. Helyi ákámazás esetén példáá a IV. táblázatban felsorolt közegek hasznáhatók. Nyákahártyák kezelésénél különösen ákámas az R jelű közeg, mely krémszerű vivőanyag. IV. táblázat A = 75% DMSO B =víz C = krém, mely a következőket tartámazza: Közeg összetétele izopropil-mirisztát 3% sztearilákohol polietilénétere (Polawax) 8% squáen 3% méhviasz (fehér) 1,5% glicerin 5% tartósítószer tisztított víz mennyisége, mely 100%-ra kiegészíti a fentieket: D = Metiolát-krém, mely a következőket tartámazza: Közeg összetétele: 1 rész timerasol (adott esetben) 150 rész sztearinsav 25 rész cetilákohol 40 rész ásványolaj 100 rész glicerin •125 rész trietanolamin 10 rész polioxietflénszorbitán-monosztearát és tisztított víz mennyisége, mely 1000 részre kiegészíti a fentieket F = cinkoxid bőrbe felszívódó kenőcs 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
