177915. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
3 177915 4 elkülönítjük. Az így kapott terméket többek között takarmányok aminosav-összetételének módosítására használhatjuk fel. A találmány szerinti eljárásban termelő törzsként alkalmazott új mikroorganizmus-törzs, azaz a Brevibacterium sp. DE—84 törzs előállításához kiindulási anyagként a Brevibacterium sp. 22L törzset használjuk fel. E törzsből többlépéses szelekciós eljárással alakítjuk ki a Brevibacterium sp. DE—84 törzset; mutagén anyagként N-metil-Nl-nitro-N-nitrozo-guanidint alkalmazunk. A szelekciós eljárás folyamatábráját az alábbiakban közöljük. Brevibacterium sp. 22L I három szelekciós lépés; szelekciós alapcél: a ter-I melőkapacitás növelése Brevibacterium sp. CB—80 I Brevibacterium sp. C—88 I szelekciós lépés; cél a fágokkal szembeni ellenálló-I képesség növelése Brevibacterium sp. DE—84 ; szelekciós lépés; cél a termelőkapacitás növelése A fágokkal szemben ellenálló mutánsok kialakítása során a Brevibacterium sp. CB—80 törzs sejtjeit a mutagén anyaggal kezeljük, majd lenyomatképzési módszerrel, fágokkal történő érintkezés nélkül kiválasztjuk a fágokkal szemben ellenálló variánsokat. A szelekciós módszert a 203 838 sz. szovjet szerzői tanúsítvány ismerteti. Az így kialakított Brevibacterium sp. C—88 törzset a termelőkapacitás növelése céljából további szelekciós lépésnek vetjük alá; ekkor a Brevibacterium sp. DE—84 törzset kapjuk. A Brevibacterium DE—84 törzs a fágokkal szembeni ellenállóképességen és a fokozott lizintermelő kapacitáson kívül még számos ismérv tekintetében eltér a kiindulási Brevibacterium sp. 22L törzstől. Az L-lizint termelő Brevibacterium sp. DE—84 törzset az Összoroszországi Genetikai Kutatóintézet törzsgyűjteményében B—1338 számon helyeztük letétbe. A következőkben a Brevibacterium sp. DE—84 törzs morfológiai, fiziológiai és tenyésztési jellemzőit ismertetjük. Morfológiai jellemzők: ovális, rövid (1,2x2,5 jj.m), spóramentes, Gram-pozitív, nem mozgó sejtek. Fiziológiai és tenyésztési jellemzők: A törzs hús-pepton-agar táptalajon tenyésztve a 7. napon 3,5—4,0 mm átmérőjű, narancsvörös színű, kerek telepeket képez. A telepek pereme sima, közepe kúposán kiemelkedik; a kúpos kiemelkedést 2—3 koncentrikus, sekély redő veszi körül. Karcolásos oltás esetén a 2. napon bőséges növekedés észlelhető; a növekmény pereme sima, felülete sima és fényes, profilja pedig lapos és narancsvörös. Glükózt tartalmazó Glover-féle minimum-táptalajon a törzs növekedéséhez biotin, tiamin, homoszerin (vagy metionin és treonin) és hisztidin szükséges. Ezen a táptalajon a törzs a tenyésztés 7. napján 1,2—1,5 mm átmérőjű, kerek, sima szélű telepeket képez; a telepek profilja gömbszerű és narancsvörös színű. Karcolásos oltás esetén bőséges növekedés észlelhető; a növekmény pereme sima, felülete sima és fényes, profilja pedig lapos és narancs vörös. A törzs a vizsgált szénforrások közül a glükózt, szacharózt, maltózt és galaktózt jól, a xilózt, etanolt, nátriumacetátoí és ammóniumacetátot gyengébben, míg a laktózt egyáltalán nem asszimilálja. A vizsgált nitrogénforrások közül a törzs az ammóniumkloridot, ammóniumszulfátot, ammóniumnitrátot és karbamidot asszimilálja. A törzs 0B-fágokkal szemben teljes mértékben rezisztens; nagy mennyiségű (10® részecske/ml) fágok jelenlétében is szabályosan növekedik és mintegy 40 g/1 lizint termel. A 0B-fágok a Brevibacterium sp. DE—84 törzsre — a Brevibacterium sp. 22L törzzsel ellentétben — sem szilárd, sem folyékony táptalajon gyakorlatilag semmiféle hatást nem fejtenek ki. Az L-lizin feldúsulását a fermentációs közegben különböző fermentációs körülmények között vizsgáltuk; termelő törzsként fágokra érzékeny és fágokkal szemben rezisztens Brevibacterium sp. törzseket alkalmaztunk. A fermentációt 0B-fágok jelenlétében és távollétében egyaránt vizsgáltuk; főkomponensekként melaszt és kukoricalekvárt tartalmazó fermentációs közegeket alkalmaztunk. A fermentációt 750 ml űrtartalmú lombikokban 72 órán át 30—32 C°-on végeztük. Az észlelt eredményeket az 1. táblázatban közöljük. 1. táblázat Brevibacterium sp« törzs L-iizin g/i (0B-fágok távollétében 0B-fágok jelenlétében végzett fermentáció L-lizin g/1 Napi faktor (részecske/ml) Fermentáció előtt Fermentáció után 22L 31,3 0 108 1010 C—88 33,6 32,2 108 104 DE—84 36,0 35,5 108 104 Az 1. táblázat adataiból megállapíthatjuk, hogy a Brevibacterium sp. DE—84 törzs fágok jelenlétében és távollétében egyaránt közel 40 g/1 L-lizint termel. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példában ismertetjük. Példa Hús-pepton-agar táptalajon 24 órán át 30 C°-on tartott Brevibacterium sp. DE—84 tenyészetet 750 ml űrtartalmú lombikba töltött 30 ml táptalajhoz adunk. A táptalaj összetétele a következő: melasz 16,0 súly% kukoricalekvár 5,6 súly% ammóniumklorid 2,5 súly% kálium-dihidrogénfoszfát 0,1 súly% kalciumkarbonát 1,0 súly% víz q.s. ad 100,0 súly% Sterilizálás után a táptalaj pH-ját steril vizes nátriumhidroxid-oldattal 7,0 és 7,5 közötti értékre állítjuk. A lombikokat köralakú rázóasztalra szereljük, és a rendszert 18—24 órán át 30—32 C°-on, 240 fordulat/perc sebességű forgatás közben tenyésztjük. A fenti eljárással kapott oltóanyaggal 750 ml űrtartalmú fermentációs lombikokba töltött fermentációs közegeket oltunk be. A fermentációs közeg összetétele a következő: melasz 20,0 súly% (cukorra vonatkoztatva: 10 súly%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
