177884. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a di-O-on(n-hosszúszénláncú- alkil- vagy alkenil)-glicinek aminszármazékainak előállítására
27 177884 28 talmazza (az LD50-érték jelenti azt a fertőző anyagmeny - nyiséget, amely 10 napon belül elpusztítja a nem védett egerek 50%-át). A túlélési adatokat a következő 10 napon jegyezzük föl, és a relatív túlélési értéket (Sr) kiszámítjuk. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. 1. táblázat A példa szerinti vegyület Sr (hét kísérlet átlaga) adagolt mennyisége (mg/kg) 15 61 5 45 1,5 24 A hatóanyag vírusellenes hatását a fertőzést követő 10. napon kapott relatív túlélés (Sr) és a kontrollal kapott adat összehasonlításával határozzuk meg. Az Srértéket a következő egyenlet szerint határozzuk meg: Sx+ Xe, i = l—10 i = l—10 i = l—10 ahol Sr relatív túlélés, Sx a túlélés %-a a kísérleti csoportban a 10. nap után, X; a túlélők száma az i. napon a kísérleti csoportban, e4 a túlélők száma az i. napon a kontroll csoportban. II. példa Az I. példában megadott módon a következőkben megadott vegyületek in vivo hatását határozzuk meg az enkefalomiokarditisz vírussal szemben. 2. táblázat A vizsgált vegyület előállítására vonatkozó példa X7ÄT1V* Sr-érték a következő mg/kg-ban megadott dózisoknál 15 1 5 1,5 ! 0,5 13. 71 49 20 6 14. 62 47 18 •— 15. 80 72 20 — 16. 74 46 4 — 17. 57 42 3 — 18. 64 58 15 — 19. 74 44 34 — 20. 46 7 6 — 21. 45- 5 4 — 22. 70 36 3 — 23. 37 31 12 0 24. 44 30 8 — r 25. 68 43 2 — 26. 66 45 17 — 27. 68 28 33 — 28. 60 63 16 — 29. 53 34 16 7 30. 56 35 20 6 1. 99 26 54 — III. példa Az l,3-di-0-(n-hexadecil)-2-0-(3-amino-propil)--glicerin-hidrogén-klorid in vitro hatása a humán polipsejtek vírushozamának csökkentésére Eagle minimál táptalajának 100 ml-ét 2 ml 100-szorosan tömény antibiotikum-antifungális oldattal 1 ml 200 mM-os glutamin-oldattal, 1 ml 100 X töménységű nem esszenciális aminosav-oldattal, 1 ml 10 mM-os nátriumpiruvát-oldattal és 10% hővel inaktivált borjúszérummal kiegészítve táptalajt készítünk. 96 helyes mikrotiter lemezeket körülbelül 50 000, 0,2 ml táptalajba szuszpendált humán nazális polipsejttel oltunk be, 8— 10 napon át 37 C° hőmérsékleten és 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáljuk a lemezeket az egyrétegű sejtkultúra előállítására. A 8—10. nap végén a lemezeken összefüggő egyrétegű sejtek fejlődnek ki, amelyeket 4 x foszfát pufiért tartalmazó sóoldattal mosunk, majd közvetlenül ezután helyenként 0,2 ml, a példa szerinti vegyületből 10, 5,0,1,0,0,5, 0,1 és 0 [xg/ml-t tartalmazó, 0,2 ml térfogatú fenntartó táptalajjal kezelünk. A fenntartó táptalaj összetétele azonos a növesztést biztosító táptalaj összetételével, azzal a különbséggel, hogy a borjúszérumból 2%-ot tartalmaz. További 18 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd 4x foszfát pufiért tartalmazó sóoldattal mossuk az egyrétegű sejttöméget a hatóanyag eltávolítására. Ezt követően vezikuláris sztomatitisz vírussal (VSV) két órán át 37 C° hőmérsékleten fertőzzük a sejttenyészetet, a vírusmennyiséget a TCIDJ0-érték 1000-szeresére állítjuk be (a TCID50-érték a nem védett sejttenyészetben 50%-os fertőzést okoz). Az adszorpciós szakasz lejárta után 4 x foszfát puffert tartalmazó sóoldattal mosva eltávolítjuk a nem adszorbeálódott vírusrészecskéket, majd ismét 0,2 ml fenntartó táptalajt töltünk a lyukakba. Ezután 7 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a lemezeket, majd mindegyik lemezről 5—8 replika-sejt tenyészlevét összegyűjtjük, fagyasztva tároljuk, és végül az L—929 egér fibroblaszt lemezeken meghatározzuk a fertőző vírusok számát. Az L—929 egér fibroblaszt sejttenyészeteket mikroszkopikusan vizsgáljuk, és 3—4 nappal később analizáljuk az adatokat. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg öt hatóanyagkoncentrációra vonatkoztatva. 3. táblázat A vizsgált vegyület koncentrációja ([Jig/ml) 10_______5,0 1,0________0!5_______04 A vírushozam %-os csökkenése 94% 90% 84% 75% 68% IV. példa A III. példában megadottak szerint eljárva a következő vegyületek in vitro hatását határozzuk meg a humán polipsejtek vírushozamának csökkenésére. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
