177222. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusellenes, új tetraciklononán-származékok előállítására
5 177222 6 Az R" helyén hidroxil-csoportot tartalmazó (III) általános képletű kiindulási anyagokat úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelő karbonil-vegyületet hidroxilaminnal reagáltatjuk. A reakciót például a 6. példában ismertetett körülmények között hajthatjuk végre. Az R4 helyén hidrogénatomtól eltérő szubsztituenst tartalmazó közbenső karbonil-vegvületek előállítása során a megfelelő 8-ciano-vegyiileteket Grignard-reakciónak vethetjük alá (ezt az eljárást a 6. példa részletesebben ismerteti). Az R! helyén alkil-csoportot tartalmazó (III) általános képletű kiindulási anyagok képződéséhez vezető származékokat a megfelelő 8-ciano-vegyületek alkilezésével alakíthatjuk ki. A reakciót például a 9. példában ismertetett körülmények között hajthatjuk végre. A B helyén metilén-csoportot, R ’ helyén hidrogénatomot és X helyén ciano-csoportot tartalmazó (III) általános képletű vegyületet all. példában közölt módszerrel állíthatjuk elő. A találmány szerinti (c) eljárásváltozatban felhasznált kiindulási anyagokat például úgy alakíthatjuk ki, hogy a megfelelő oximokat piridines közegben acilezzük, majd a kettős kötést redukáljuk, és az acil-vegyületet hidrolizáljuk. A reakciókat például a 14. példában ismertetett körülmények között hajthatjuk végre. Miként már közöltük, a (II) általános képletű vegyületek és gyógyászati lag alkalmazható savaddíciós sóik számos influenza-vírussal szemben hatásosak. A vegyületek aktivitását in vitro körülmények között borjú-vesesejteken tenyésztett vírusokon is kimutathatjuk, egy előnyösebb kísérleti módszer szerint azonban kísérleti egyedekként menvét-légcsőgyűrűkön tenyésztett vírusokat használunk fel. Ez az utóbbi kísérleti módszer az előbbinél sokkal megbízhatóbban jelzi a vegyületek aktivitását, ugyanis kísérleti közegként a vírus szokásos támadási pontjait képező, melegvérűekből származó szervrészleteket alkalmaz, így lényegében a tiszta in vitro és tiszta in vivo vizsgálatok közötti átmenetnek tekinthető. A legelőnyösebbnek bizonyult vegyületek és kompozíciók aktivitását egéren is megvizsgáltuk. Ezek a vegyületek jelentős mértékben csökkentették az influenza-vírusok növekedését a fertőzött állatok tüdejében. A menyét-légcsőszegmenseken végzett kísérleteket a következő körülmények között hajtottuk végre : 3 hónapos menyétek légcsövét aszeptikus körülmények között kimetszettük, és a légcsövet keresztirányban szövetgyűrűkké vágtuk szét. Egy-egy légcsőből körülbelül 30 40 szegmenst készítettünk. A légcsőszeleteket egy-egy 9 x 1 cm méretű steril üvegkémcsőbe helyeztük, és a légcsőszeletekre 0,5 ml steril fenntartó közeget töltöttünk, amely ismert koncentrációban tartalmazta a vizsgálandó vegyületet. A vegyületeket a kövekező koncentrációkban vizsgáltuk: 45 pg/ml, 9pg/ml, 1,8 pg/ml. 0,4 pg/ml, 0.08 pg ml és 0 pg/ml. Minden egyes koncentrációérték esetén három kísérletet végeztünk. A kémcsöveket kémesőállványba helyezve éjszakán át 37 C -on inkubáltuk. és ezalatt a légcsőszeletek megfelelő nedvesítésének biztosítása érdekében a kémcsőállványt enyhén forgattuk. Másnap reggel minden egyes légcsőszeletet kis felbontóképességű mikroszkóp alá helyeztünk, és megvizsgáltuk a szeletek belső falán lévő, még lüktető csiliók részarányát. Az eredményeket a következő számadatokkal jellemeztük: 4 = a csiliók 100%-a lüktet, 3 = a csiliók 75°,,-a lüktet. 2 — a esiliók 50%-a lüktet, 1 = a csiliók 25"„-a lüktet, 0 = egyetlen esilló sem lüktet. E vizsgálat eredményei arra adnak felvilágosítást, hogy a hatóanyag gyakorol-e toxikus hatást a csillókkal borított felhámra. \ Ezután minden kémcsőmbe előre meghatározott meiiynyiségű influenza-vírust vittünk be, és a kémcsöveket 2 órán át 37 C-on inkubáltuk. Ezalatt az idő alatt a vírusok megtelepedtek a szövetszeletek sejtjein, illetve behatoltak a sejtekbe, és megindult a fertőzési folyamat. 2 óra elteltével a vírustartalmú folyadékfázist dekantálással eltávolitottuk, a szövetszeleteket friss tápoldattal enyhén mostuk, majd a szövetszeletekhez újabb 0,5 ml hatóanyagtartalmú tápoldatot adtunk. A szövetszeleteket másnap reggelig az előzőekben ismertetett módon 37 ' C-on inkubáltuk, majd megvizsgáltuk a csillókkal bontott felhám állapotát. A megfertőzetlen mintákkal végzett kontroli-vizsgálatban kapott érték a hatóanyag toxieitását, a kezeletlen, megfertőzött mintákkal végzett kontroli-vizsgálatban kapott érték a vírus által okozott károsodást, míg a további vizsgálatokban kapott értékek a hatóanyag által kiváltott védőhatást jellemzik. Az azonos hatóanyagkoncentrációjú tápoldatot tartalmazó 3-3 kémcsőben lévő folyadékfázist egyesítettük, az egyesitett mintákhoz 0,3 ml steril szarvasmarha-plazmaalbumint adtunk, majd a mintákat — 20 C-on fagyasztottuk és további vírustitráláshoz félretettük. A hármas kémcsőcsoportokban maradt légcsőszeletekhez friss hatóanyagtartalmú tápoldatot adtunk, és az inkubálást folytattuk. Ezt a műveletet háromszor ismételtük meg, vagyis minden egyes hatóanyagkoncentráció esetére (valamint a kontroli-vizsgálatokban) négy-négy folyadékmintát különítettünk el. A fagyasztott mintákat 37 C-on felengedni hagytuk, majd a minták vírustartalmát primer borjú-vesesejteken titráltuk. A titrálást az ismert kvantitatív haemadszorpciós módszerrel végeztük (N. B. Finter: Ann. N. Y. Acad. Sei. 173, 131 [1970]). A végzett vizsgálatokkal tehát a csillókkal borított légcső-felhámon növekedő influenza-vírusokra gyakorolt hatást vizuális módszerrel és kvantitatív méréssel egyaránt meghatározzuk. A példákban ismertetett valamennyi vegyület hatásosnak bizonyult e kísérletben A, és A, influenza-vírusokkal szemben: egyes származékok A„ influenza-vírussal szemben is aktivitást mutattak. A példákban ismertetett valamennyi vegyület e kísérletben 5 pg/ml vagy annál kisebb koncentrációban A,HK influenza-vírussal szemben hatásos volt: a vegyületek toxieitás/aktivitás aránya 9-től 550-nél nagyobb értékig terjedt. E kísérletben az ismert 8- -amino-tetraciklo-[4,3.0.0:'4,0? T]nonán még 50 pg ml koncentrációban sem mutatott aktivitást A,UK influenza-vírussal szemben. . A következőkben az egereken végzett kísérleteket ismertetjük. A kísérletekhez két, egyenként 10-10 specifikus, patogénmentes hím fehér egérből (testsúly : 20-- 22 g) álló csoportot használtunk fel. Az egyik állatcsoport tagjainak orális úton 125 mg kg (= 2,5 mg egér). a másik állatcsoport tagjainak ugyancsak orális úton 50 mg kg (= 1.0 mg egér) mennyiségű hatóanyagot adtunk be. 10 azonos állatból álló csoportot kontrollként vizsgáltunk. 2 óra elteltével az egereket egyenként aeroszolos kamrába helyeztük, és az egereket fél órára influenza-vírust tartalmazó aeroszol hatásának tettük ki. A megfertőzés után egy órával, majd négy órával az első két csoportba tartozó állatoknak < 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
