177133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-és helyzetben alfa-aminooxisavat tartalmazó angiotenzin-II-antagonista hatású angiotenzin-II analógok előállítására
7 177133 8 A vékonyrétegkromatogramok előhívására egyrészt ninhidrin-oldatot használtunk, másrészt a szokásos klórozás után o-tolidin-kálium-jodid-oldattal hívtuk elő. A papírelektroforetikus vizsgálatok LMIM középfeszültségű horizontális készülékben (a Labor Műszeripari Művek, Budapest, gyártmánya) történtek MN 214 papíron (Machery-Nagel Co., NSzK), pH - 1,9-es pufferben Glu mellett. A feszültség 450 V, az idő 3 óra volt. A végtermékek tisztítása a következő általános módszer szerint történt; a szabad peptidek hidrogénfluoridos sóit először Sephacryl S-200 Superfine gyantán (a Pharmacia Fine Chemicals AB svédországi cég gyártmánya) gradiens elúcióval tisztítottuk 0,01 mól( pH = 4,5) és 0,4 mól (pH = 6,7) ammóniumacetát-oldatok segítségével. Az eluátum regisztrálását LKB Uvicord—II készüléken (az LKB—Produkrer AB svédországi cég gyártmánya) automata frakciószedő segítségével végeztük. A főfrakció további tisztítása karboximetilcellulózon (CMC) a következőképpen történt: 0,5 liter CMC-t (CMC—52) az induló pufferrel oszlopon egyensúlyba hozíunk, majd az oszlopra 0,5 g 4 ml 0,01 mólos ammóniumacetátban oldott peptidet rétegeztünk és megkezdtük a gradiens elúciót a fenti puffer-keverékkel. Az áramlási sebesség 25 ml/óra volt és 10 ml-es frakciókat szedtünk, amelyeket LKB Uvicord-II készüléken regisztráltunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciót liofilizálva jutót bank a homogén végtermékekhez. 1. példa (Aminooxiacetil1. Ile8)-angiotenzin-II előállítása 1. lépés Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB 4,5 g (15mmól) Ile-ONB • HCl-t 50 ml kloroformban oldunk és hozzáadunk 2,1 ml trietilamint és 3,81 g (10 mmól) Boc-Pro-OPFP-t. 20 perces szobahőmérsékleten történő keverés után az oldatot vízzel és 10%-os vizes citromsav-oldattal kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett dipeptidet (Rf = 0,8) izolálás nélkül 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, 10 perc múlva az oldatot 60 ml száraz éterrel hígítjuk és bepároljuk. A szabad dipeptid-hidrokloridot (R| = 0,44) 30 ml kloroformban feloldjuk, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 8,8 g (15 mmól) Boc-His(Dnp)—OPFP-t. Másfél óra múlva az oldathoz 1,65 ml N N -dimetilaminoetilamint adunk és 15 perc múlva 15-15 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval, vízzel és 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tripeptidet (RJ 0,50) izolálás nélkül 20 ml 8n sósavas dioxánban feloldjuk, majd 15 perc múlva a szabad tripeptidet (Rf = 0,25) száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és éterrel mossuk. Ezután azonnal feloldjuk 50 ml kloroform és 20 ml dimetilformamid elegyében, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 6,0g(15mmól) Boc-Ile-OPFP-t. 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 70 ml etilacetátban oldjuk és 25—25 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tetrapeptider. Rf = 0,65) 80 ml 1:9 térfogatarányú éter : : n-hexán elegy segítségével izoláljuk. Ezután 25 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, majd 30 perc múl'/a a szabad tetrapeptidet (Rf=0,41) 120 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Ezt követően azonnal feloldjuk dimetilformamid : kloroform = 1:1 elegyében 6/70 ml), az oldat pH-ját 8-ra állítjuk írierilaminnal és hozzáadunk 6,0 g (11,5 mmól) Boc-Tyr(Bzl)—OPFP-t. 15 perc múlva az. oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml etilacetátban oldjuk, hozzáadunk 0,66 ml N,N-dimetilaminoetilamint és 15 perc múlva 30—30 ml 10%-os vizes citromsavoldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett pentapeptidet (*Rf = 0,59) 100 ml éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük és 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Ezután 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, 15 perc múlva a szabad pentapeptidet (Rf=0,4) 120 ml száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és 30—30 mi éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilforrnamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 4,62 g (12 mmól) Boc—Val—OPFP-t. Egy óra múlva az oldószert elpárologtat; uk, a maradékot 100 ml kloroformban oldjuk és 30-30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval, majd vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett hexapeptidet (Rf = 0,56) éter segítségével izoláljuk, éterrel mossuk. Ezután 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és a szabad hexapeptidet (Rf=0,47) 120 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilforrnamidban, az oldat pH-ját trietilaminnal 8-ra állítjuk és hozzáadunk 7,2 g (12 mmól) Boc—Arg(Tos)-OPFP-t. Egy órai keverés után az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 30—30 ml 10%-os vizes citromsavoldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 100 ml éterrel eldörzsöljük és leszűrjük, így a dm szerinti védett heptapeptidet kapjuk. Súlya: 12,4 g (80% a kiindulási Boc—Pro-OPFP-re számolva). Op.: 189-192 °C. R? =0,55. 2. lépés Boc-OGLy-Arg(Tos)-Val-Tyr—He—His— —Pro—Ile—OH 3,1 g (2 mmól) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB-t 5 ml dimetilformamidban feloldunk és hozzáadunk 2,9 ml 2-merkaptoetanolt. Egy óra múlva a peptidet 100 ml száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük, mossuk éterrel, majd me5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
