177070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BM.123 gamma antibiotikum, alkilezett származékainak előállítására
23 177070 24 spektroszkópiával és bioautográfiás úton (Klebsiella pneumoniae AD törzzsel beoltott, nagy agarlemezekre helyezett, a vizsgálandó eluátumfrakcióval átitatott szűrőpapír-korongok felhasználásával) vizsgáljuk. E vizsgálatok szerint a BM123y antibioti- 5 kum a 64—90. frakcióban dúsűl fel. A 64—80. frakció BM1237, és BM123y2 antibiotikum keverékét tartalmazza, míg a 81-90. frakció lényegében tiszta BM1237i antibiotikumot tartalmaz. 100 ml, 20 40 mesh szemcseméretű Darco 10 G—60-at vízben szuszpendálunk, a szuszpenziót üvegoszlopba töltjük, a szénszemcséket ülepedni hagyjuk, majd a víz fölöslegét lecsurgatjuk. Az előző kromatográfiás műveletben kapott 81—90. frakciót egyesítjük és átbocsátjuk az oszlopon. Az 15 oszlopot 500 ml vízzel mossuk, majd 500 ml 10%-os, vizes metanollal, végül 1 liter 50%-os, vizes metanollal eluáljuk. Az 50%-os, vizes metanol felhasználásával kapott eluátumot (pH = 5,9), amely a BM1237! antibiotikum főtömegét tartalmazza, 20 hidroxil-formájú Amberlite IR-45 gyantával 6,0-ra semlegesítjük. A gyantát kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban betöményítjük. A kapott vizes koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 294 mg fehér, amorf BM1237t antibiotikumot kapunk hidroklo- 25 ridja formájában. A BM1237i antibiotikum nem rendelkezik határozott olvadásponttal, hanem körülbelül 200°€-tól kezdve fokozatosan bomlásnak indul. A 24 órán át 21 °C-os, 60% relatív páratartalmú térben tartott 30 minta elemzési adatai a következők: C = 37,84%, H = 5,73%, N= 15,58%, Cl (ionos) = 10,01%, szárítási veszteség: 10,45%. A BM1237! antibiotikum metanolos közegben felvett ultraibolya abszorpciós spektrumában 286 nm-nél észlel- 35 hető maximum (E\fm— 225). A maximum helyzete a közeg pH-jánaic változtatásával nem változik. A BM1237j antibiotikum optikai forgatóképessége + 55° (c = 0,803, vízben). A BM1237i antibiotikum káliumbromid-pasztil- 40 Iában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a 2. ábrán mutatjuk be. A spektrumban a következő jellemző csúcsértékek észlelhetők: 770, 830, 870, 930, 980, 1045, 1080, 1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345, 1380, 1465, 1515, 1560, 1605, 45 1660, 1730, 2950 és 3350 cm-1. A BM1237, antibiotikum deutériumoxidos oldatban, 100 MHz-en felvett NMR-spektrumát a 4. ábrán mutatjuk be. A BM12372 antibiotikum elkülönítése 2%-os, vizes nátriumklorid-oldattal átitatott, 55 1800 ml nátrium-formájú CM Sephadex C-25 gyantával töltött oszlopon 25 g, a 3. példában ismertetett módon előállított, fő tömegében BM 12372 3 és BM 123)3 antibiotikumot tartalmazó minta körülbelül 120 ml 2%-os, vizes nátriumklo- 60 rid-oldattal készített oldatát visszük fel. Az oszlopot 20 liter 2%-os, vizes nátriumklorid-oldattal és 20 liter 4%-os vizes nátriumklorid-oldattal grádiens-elúeió szerint eluáljuk. Az első 12 liter eluátumfrakcíót nagy tartályba gyűjtjük és elönt- 65 jük. Ezután az effluenst körülbelül 800 ml-es frakciókba foguk fel, az egyes frakciókat 40-40 perc alatt gyűjtjük össze. A frakciók BM123y antibiotikum-tartalmát ultraibolya spektroszkópiás úton vizsgáljuk. A BM123y antibiotikum főtömege a 7-18. frakcióban dúsul fel. A 7-15. frakció lényegében tiszta BM12372 antibiotikumot tartalmaz, míg a 16-18. frakcióban BM1237i és BM12372 antibiotikum elegye található. 600 ml 20—40 mesh szemcseméretű Darco G—60-at vízben szuszpendálunk, a szuszpenziót üvegoszlopba töltjük, a szénszemcséket ülepedni hagyjuk, majd a víz fölöslegét lecsurgatjuk. Az előző kromatográfiás műveletben kapott 7-15. frakciót egyesítjük és átbocsátjuk az oszlopon. Az oszlopot 3 liter vízzel mossuk, majd 3 liter 10%-os, vizes metanollal, végül 6 liter 50%-os, vizes metanollal eluáljuk. A 10%-os, vizes metanol felhasználásával kapott eluátumot (pH = 5,8) hidroxil-formájú Amberlite IR-45 gyantával pH = 6,0 értékig semlegesítjük. A gyantát kiszűrjük, a szürletet vákuumban betöményítjük, és a kapott vizes koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 595 g fehér, amorf BM12372 antibiotikumot kapunk hidroklorid-só formájában. Az 50%-os, vizes metanol felhasználásával kapott eluátumot (pH = 4,6) hidroxil-formájú Amberlite IR—45 gyantával pH = 6,0-ig semlegesítjük. A gyantát kiszűrjük, a szűrletet vákuumban betöményítjük, és a kapott vizes koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 3,645 g fehér, amorf BM12372 antibiotikumot kapunk hidroklorid-só formájában. Ez a termék az előzőekben kapott mintánál kevésbé tiszta. A BM 12372 antibiotikum nem rendelkezik határozott olvadásponttal, hanem körülbelül 200°C-tól kezdve fokozatosan bomlásnak indul. A 24 órán át 21 °C-os, 60% relatív páratartalmú térben tartott minta elemzési adatai a következők: C: 36,14%, H: 5,67%, N: 15,1%, Cl (ionos): 11,11%, szántási veszteség: 10,87%. A BM12372 antibiotikum metanolos közegben felvett ultraibolya abszorpciós spektrumában 286 nm-nél észlelhető maximum (EÍcm = 220). A maximum helyzete a közeg pH-jának változtatásával nem változik. A BM12372 antibiotikum optikai forgatóképessége + 60° (c = 0,851, vízben). A BM12372 antibiotikum káliumbromid-pasztillában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a 3. ábrán mutatjuk be. A spektrumban a következő jellemző csúcsértékek észlelhetők: 770, 830, 870, 950, 980, 1035, 1110, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 és 3350 cm-.1 A BM12372 antibiotikum deutériumoxidos oldatban, 100 MHz-en felvett NMR-spektrumát az 5. ábrán mutatjuk be. 7. példa A BM123-antibiotikumok papirkromatográfíás és vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata A BM123-antibiotikumok papírkromatográfiás úton megkülönböztethetők és elkülöníthetők egymástól. A papirkromatográfíás elemzést a követke12
