176828. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nitrogént tartalmazó tumorgátló poliszacharidok előállítására
3 176828 4 extrakciójával és a kapott extraktum tisztításával. Az eljárást az jellemzi, hogy a gomba extrakcióját 50—100 °C- on több lépésben hajtjuk végre, az első extrakciót vízzel vagy híg vizes lúg-oldattal, a második extrakciót az elsőnél eggyel nagyobb, de legfeljebb 2,0 normalitású vizes lúg-oldattal, a harmadik extrakciót a másodiknál eggyel nagyobb, de legfeljebb 2,0 normalitású vizes lúgoldattal végezzük és a kapott extraktumból az 5000-nél kisebb molekulasúlyú anyagokat ultraszűréssel és/vagy fordított ozmózissal távolltjuk el. Látható tehát, hogy a kiindulási anyagot a kívánt, nitrogént tartalmazó poliszacharid előállítása céljából a találmány szerinti eljárás értelmében többszörös extrakciónak vetjük alá. A többlépéses extrakciót fokozatosan növekvő koncentrációjú vizes lúg-oldatokkal végezzük, de lehetőség van arra is, hogy az egymást követő extrakciós lépésekben azonos koncentrációjú oldatokat használjunk az extrakcióhoz. A „híg vizes lúg-oldat” kifejezés alatt olyan vizes oldatot értünk, amelynek pH-értéke a gombával való összekeverés után megközelítően 7, vagy ennél kisebb. Ez a definíció azon a tényen alapul, hogy ha a gombát tiszta vízzel vagy körülbelül 0,01 n vizes nátrium-hidroxid oldattal keverjük el, az így kapott oldat pH-értéke 4 és 7 között marad, a gomba puffer hatása következtében. A fokozatosan növekvő koncentrációjú vizes lúg-oldatok töménységét előnyösen úgy választjuk meg, hogy a legnagyobb koncentráció legfeljebb 2 n legyen. Ha ugyanis az extrakciót ennél nagyobb koncentrációjú oldatokkal végezzük, fennáll a hatóanyag elbomlásának veszélye. A vizes oldószert a kiindulási anyag száraz súlyára számítva 5—200-szoros mennyiségben használjuk valamennyi extrahálási lépésben, és az extrakciót 50—100 °C-on, 20 perc és 5 óra közötti időtartamig végezzük. 50 °C alatt rossz az extrakció hatásfoka, míg 100 °C felett a végtermék károsodhat. Az extrakciót általában 2—10, előnyösen 3—8 lépésben végezzük. Függetlenül az extrakciós lépések számától a melegítési időt előnyösen 20 óra alatt tartjuk a hatóanyag bomlásának megakadályozása céljából. Ha megfelelő extrakciós hatásfokot kívánunk elérni, célszerű gondoskodni arról, hogy a teljes melegítés ideje legalább 1 óra legyen. A találmány szerinti eljárás során felhasználható lúg lehet például nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid, kalcium-hidroxid vagy ammónia, legelőnyösebben nátrium-hidroxid. 5 A találmány szerinti több-lépcsős extrakciós eljárás a szokásosnál nagyobb kitermelést biztosít, és így ipari méretekben is kiválóan alkalmazható. Az extrakciós hatásfok megnövelésének mechanizmusa nem pontosan ismert, de feltételezhető, hogy a találmány 10 szerint végzett extrakció során nemcsak a Basidiomycetes oldható komponensei eluálódnak, hanem maga a Basidiomycetes is bomlik kis mértékben, ami megkönynyíti a hatóanyag kivonását. Ha úgy járunk el, hogy az extrakciót kezdettől fogva 15 nagy koncentrációjú vizes lúg-oldattal végezzük, megelőző vizes vagy híg lúg-oldatos extrakció nélkül, az extrakció hatásfoka viszonylag nagy ugyan az első lépésben, de a következő lépésekben hirtelen csökken. Ez feltehetően azzal magyarázható, hogy az erélyesebb kö- 20 rülmények között a forró vízzel vagy híg vizes lúg-oldattal extrahálható frakció (cél vegyület) bomlást szenved, így a kívánt termékhez képest megnő az 5000-nél kisebb molekulasúlyú melléktermékek részaránya. A kapott extraktumot szokásos módon, ásványi sav- 25 val, például híg vizes sósav-oldattal semlegesítjük, majd tisztítjuk. Az extrakció bármely lépésében kapott extraktumot tovább tisztíthatjuk, vagy eljárhatunk úgy is, hogy a kapott extraktumokat egyesítjük és az így kapott oldatot tisztítjuk tovább. 30 A tisztítást ismert módszerekkel, például ultraszűréssel, fordított ozmózissal, gélszűréssel, kisózással vagy szerves oldószeres kicsapással végezhetjük, ahol az egyes módszerek önmagukban vagy más eljárásokkal kombinálva alkalmazhatók. 35 A tisztítás után kapott nitrogént tartalmazó poliszacharid analízise azt mutatta, hogy a termék elsősorban szenet, nitrogént, hidrogént és oxigént tartalmaz. Nitrogéntartalma a kiindulási anyag nitrogéntartalmától függően változik, de rendszerint meghaladja a 2 súly%-ot, 40 legtöbb esetben pedig 3 és 5 súly% között van. A termékkel végzett színreakciók eredményeit az 1. táblázatban soroljuk fel. 1. táblázat Színreakció Szín Eredmények a-naftol-kénsavas reakció (Molish reakció) bíbor szacharidok jelenléte indol-kénsavas reakció (Disch reakció) barna szacharidok jelenléte antron-kénsavas reakció zöldeskék szacharidok jelenléte triptofán-kénsavas reakció bíbor-barna szacharidok jelenléte Lowry-Folin reakció kék peptid-kötések jelenléte sósavas hidrolízis, majd ninhidrin-reakció bíbor-kék a-aminosavak jelenléte Az 1. táblázatban felsorolt adatok azt igazolják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított termék egy nitrogéntartalmú poliszacharid, amely primer peptidkötésben kapcsolódó nitrogént tartalmaz. A termék oszlopkromatográfiás módszerrel meghatározott molekulasúlya megközelítőleg 5000 és 30 0000 közötti érték, ultracentrifugás módszerrel meghatározott súlyarányos molekulasúlya pedig 10 000 és 100 000 közötti érték. Az 5000 alatti molekulasúlyú frakciók Sarcoma—180- nal szemben mutatott gátló hatása egereken, intraperitoneális adagolás esetén csaknem nulla, ezenfelül ízük kesernyés, szaguk kellemetlen és nemkívánatos mellékreakciókat mutatnak. Ezeket a frakciókat miután nem járulnak hozzá a találmány szerinti nitrogént tartalmazó poliszacharidok farmakodinamikus tulajdonságaihoz, ugyanakkor károsan befolyásolják a termék minőségét, eltávolítjuk az előállított termékből. 60 65 2
