176598. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillán-sav előállítására penicillinek enzimatikus dezacilezésével
3 176598 4 lyozási problémát, és a szakaszos eljárásoknál fellépő nehézkes katalizátorkezelési problémát is. Az eljárás megoldja a pH-szabályozást, ami lényeges, mivel a dezacilezésnél karbonsav képződik, melyet semlegesíteni kell. Az enzim csak egy szűk pH tartományban működik optimálisan, és mind a reakcióban részt vevő anyagok, mind a termék érzékeny a nagyobb pH-változásokra. Mivel ugyanakkor a nyomásesés az ágyon minimális, egyszerű ipari berendezések használhatók. Az eljárás alkalmas bármely vízoldható penicillin dezacilezésére. Ilyen penicillin például a penicillin G (benzil-penicillin), a penicillin X (p-hidroxi-benzil-penicillin) és a penicillin V (fenoxi-metil-penicillin). Előnyös a penicillin G kálium- vagy nátriumsója. A penicillin-szubsztrát koncentrációja a vizes oldatban nem kritikus, általában 1 és 20 g/100 ml oldat között változhat. Szemcsés immobilizált penicillinaciláz katalizátoron olyan penicillinaciláz enzimet, vagy bármely penicillinacilázt termelő mikroorganizmust értünk, melyek a szerves vagy szervetlen eredetű, vízben nem oldható szemcsés mátrixok közé vagy azokhoz kötődnek oly módon, hogy az enzim megtartja aktivitását. Megfelelő, penicillinacilázt termelő mikroorganizmusok például a Proteus, Escherichia, Streptomyces, Nocardia, Micrococcus, Pseudomonas, Alkaligenes és Aerobacter nemzetségekhez tartozó fajok, melyeket például a 3.260.653 és 3.953.291 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek. Az enzimek és mikroorganizmus sejtek immobilizációjának szokásos módjai a mátrixhoz való kovalens kötés, a mátrixba való beépítés, fizikai adszorpció a mátrixra, és egy bifunkciós reagenssel keresztkötéssel mátrixképzés. A 3.645.852, 3.708.397, 3.779.869, 3.925.157, 3.953.291, 3.736.231 és 3.957.580 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ilyen immobilizációs eljárásokra vonatkoznak. Amint a fenti irodalmi helyekből kitűnik, a mátrix általában az alábbi monomerek pölimerje vagy kopolimerje; glicidil-metakrilát, metakrilsavanhidrid, akriloilamid, akrilamid, sztirol, divinil-benzol vagy glükóz, a mátrix lehet esetleg bentonit, por-alakú szén, titánoxid, alumíniumoxid vagy üveg. Előnyös katalizátor, amelyben a penicillinacilázt tartalmazó Proteus rettgeri sejteket a 3.957.580 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint immobilizáltuk. Az ilyen szemcsés katalizátorok aktivitása általában 200 és 5.000 egység között van (mikrontól penicillin G, dezacilezés per óra/száraz katalizátor-grammonként). A szemcsés katalizátort vékony ágy formájában használtuk, melyen az anyagáram gyorsan recirkulál. Vékony ágyon legfeljebb 6 cm mély ágyat értünk. Az ágy aktuális vastagságát a kívánt konverziófok, a szemcsés katalizátor aktivitása és — immobilizált mikrobasejtkatalizátOr esetén — a szemcsés katalizátorban levő sejtek koncentrációja határozza meg. Az ágynak elég vastagnak kell lennie, hogy kívánt konverziófokot a megfelelő enzimaktivitás biztosítsa, de nem szabad gátolnia az átfolyás sebességét. Adott esetben célszerű a katalizátort például kovafölddel, perlittel vagy porított cellulózzal az ágy térfogatának 80%-ig terjedő mennyiségben keverni, hogy az ágy szerkezete porózusabb legyen. Az 1—6 cm vastagságú ágyak általában biztosítják a kívánt konverziófokot és átfolyási sebességet. Az ilyen ágyak készítésére kiválóan megfelelnek a vízszintes kamrás vagy keretes szűrőprések. Az átalakítás szabályozott hőmérséklet és pH viszonyok között történik, így a konverziófokot növeljük, ugyanakkor az anyag, termék és katalizátor bomlásának a veszélyét a minimumra csökkentjük. A hőmérséklethatárok 15 és 45 °C között vannak, előnyösen 35—40 °C között. A katalizátor aktivitása 15 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleteken jelentősen csökken, míg a 45 °C-nál magasabb hőmérsékletek a penicillin és a 6-APA nagymértékű bomlását és a katalizátor denaturálódását eredményezik. Amint azt említettük, a pH szabályozása a penicillinkonverzió miatt kritikus, ezért az eljárás pH-ja 6,5 és 9,0 között van. A 6,5-nél alacsonyabb pH-érték jelentősen csökkenti az enzim aktivitását, ugyanakkor fokozza a penicillin bomlását, míg a 9,0-nál magasabb pH-érték nemcsak a penicillin bomlását, de az enzim denaturálódását is fokozza. Ezért, ha a katalizátor a Proteus rettgeriből származik, a pH-érték előnyösen 7,5 és 8,2 között van. A gyakorlatban az anyagáram nagyrészét kevert tartályban vagy edényben a kívánt hőmérsékleten és pH-értéken tartjuk. Az anyag egy kis része folyamatosan áramlik át a katalizátorágyon, és gyorsan visszatér a tartályba, ahol az ágyon történő áthaladás során keletkező savat lúggal, például nátrium-hidroxiddal semlegesítjük, hogy a pH-t a megfelelő határok között tartsuk. Ez a megoldás alkalmazható szakaszos üzemmódban, félfolyamatos vagy folyamatos eljárásban is. Az anyagáram átfolyási sebessége kritikus jelentőségű a penicillin 6-APA-vá történő optimális konverziója szempontjából, és értéke legalább 0,4 ágytérfogat percenként. Az ezen értéknél alacsonyabb átfolyási sebességek nemcsak a katalizátor-felhasználást rontják jelentősen az anyag és a termék rosszabb diffúziója miatt, de ugyanakkor fokozzák a kiindulási anyag, a végtermék, és a katalizátor bomlását is, mivel az ágyban nő a helyi savasság. Az anyagáram átáramoltatását a katalizátorágyon addig folytatjuk, míg a penicillin nagy része (legalább 80%-a) át nein alakult. A keletkezett 6-APA-t vagy elválasztjuk, vagy a kívánt penicillin nyeréséhez a szokásos módon reagáltatjuk. Az alábbi példák a találmány szerinti eljárást közelebbről ismertetik. 1. példa Proteus rettgeri [ATCC 31052 (ATCC 9250); Pfizer Culture 18470—76—60] fermentlevet, melyet süllyesztett, aerob körülmények között 28 °C-on, 6,8—7,0 pH- értéknél kazein-szubsztrát jelenlétében végzett tenyésztéssel állítottunk elő, kicéhtrifugálunk, és a sejteket vízzel mossuk. A mosott sejtek 317 kg-jából és 2120 liter vízből szuszpenziót készítünk, 16,3 kg 25 súly%-os, vizes glutáraldehid-oídátot adunk hozzá és 17 percig 21 °C-on keverjük. Az így kezelt szuszpenzióhoz nitrogénatmoszférában 162,6 kg glicidil-rtietakrilátot adunk és a szuszpenziót két órán át 22 °C-on keverjük. Ezután az elegyhez 30,4 kg N,N'-metiléh-bisz-akrilamidot, 27,6 kg dimetil-afnino-propiortitrilt és 3,3 kg ammónium-persZulfátot ádunk 7,1 pH mellett, és két órán át 25—33 °C-on kevetjük. A kapott elegÿet szűrjük és vízzel mosva, nedves, szemcsés dezacilező katalizátort kapunk, mely száraz katalizátor grammra számítva 918 egység penicillinacilázt tartalmazott. A nedves katalizátor (5,1 kg szárazsúly) és 7,1 kg 5 10 15 20 25 30 35 4o 45 50 55 60 65 2
