176598. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillán-sav előállítására penicillinek enzimatikus dezacilezésével
6 176598 5 diatómaföld szűrősegédanyag elegyét vízzel hígítjuk, így 160 g/Iiter szárazanyag-tartalmú szuszpenziót állítunk elő. 8 tálcából álló vízszintes tálcás vákuumszűrőt (egy kamra átmérője 46 cm) vízzel 2,7 atm nyomás alá helyezünk. A katalizátor-szuszpenziót 201iter/perc sebességgel töltjük a szűrőre, és a szűrletet addig keringtetjük, míg oldat marad vissza. Az így kapott katalizátorágy a szűrőkamrákban egyenletesen helyezkedik el, vastagsága a felső tálcán 2,3cm, az összes többin pedig 2,8 cm. Az ágy térfogata 37 liter, teljes aktivitása pedig 4,32 x 106 egység. A kálium penicillin G-ből vizes oldatot készítünk oly módon, hogy 3,0 kg (97,1% tisztaságú) penicillint vízzel rázótankban 30 liter végtérfogatra oldunk. Az oldatot ezután a katalizátorágyon keresztül recirkuláltatjuk a reakcióoldat hőmérsékletét a tartályban 37—39 °C-on tartjuk a visszatérő csőre szerelt külső hőcserélő segítségével, a pH-t pedig7,8—8,1 értéken tartjuk 1 n nátrium-hidroxid-oldat segítségével. A recirkuláltatást addig folytatjuk, míg a penicillin több mint 90%-a átalakul 6-APA-vá. (A konverziófokot nátrium-hidroxid menynyiségéből állapítjuk meg.) Ezután a rendszert kiürítjük, 12 liter vízzel átöblítjük, új penicillin-oldatot készítünk, és folytatjuk a recirkuláltatást. Az anyagáramot és a mosódolyadékot egyesítjük, majd az abból vett mintát 2,3 pH-értéken 10 °C-on 0,25 térfogatnyi etilacetáttal kétszer extraháljuk, és az extrahált minta 6-APA-tartalmát megelemezzük. Az I. táblázat a rendszer működésének eredményeit foglalja össze több egymás utáni cikluson keresztül : I. táblázat Ciklus(I) 1 3 4 5 6 Kiindulási anyag: penicillin G káliumsó (kg) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Nyomásesés az ágyon (atm) Kezdet 2,9 3,0 2,9 2,8 2,8 Vég 2,9 3,0 2,8 2,8 2,8 Recirkulációs sebesség, liter/perc Kezdet 66 50 50 50 50 Vég 58 50 50 48 48 Reakcióidő, óra/mól 0,83 0,86 1,01 1,03 1,20 Konverzió, % 93 96 96 93 96 6-APA nyert menynyiség, %-ban(2> 94 82 89 94 86 (1) A 2 ciklus elektromos hiba miatt meghiúsult, az eredmények nem jellemzőek. (2) Sztöchiometrikus mennyiség a konvertált penicillinre számítva. Az extrahált terméket 40 °C-on 7,0 pH-értéknél bepároljuk, és a koncentrátum 6-APA-tartalmát 3,6 pH- értéknél kikristályosítjuk, vagy a kívánt penicillinné acilezzük. A leírt rendszert használhatjuk 9,0 pH-értéknél és 45 °C-on, vagy 6,5 pH-értéknél és 15 °C-on 1—6 cm vastag katalizátorágyat használva, a recirkulálás sebessége 0,4 ágytérfogat per percnél nagyobb. 2. példa Az 1. példa szerint készített nedves szemcsés immobilizált Proteus rettgeri sejteket (szárazsúly 5,1 kg), mely száraz katalizátor grammra számítva 690 egység penicillinacilázt tartalmaz, ezt 5,1 kg kovaföld szűrősegéd-anyaggal és megfelelő mennyiségű vízzel keverünk, így 90 g/liter szárazanyag-tartalmú szuszpenziót kapunk. Egy 16 keretes szűrőprést, melynek elemek közötti távolsága 2,54 cm, területe 723 cm2, a teljes kamratérfogat pedig 29,4 liter, vízzel 1,4—1,7 atm nyomás alá helyezünk. Ezután a katalizátor-szuszpenziót állandó sebességgel felvisszük a szűrőre, míg az ágy teljesen ki nem alakul, a nyomásesés a szűrőn 2,7 atm-ra nőtt, és a szűrletet addig recirkuláltatjuk, míg tiszta oldatot kapunk, így egyenletes, 85—90%-os telítettségű kamratöltetet kapunk. A töltet összaktivitása 3,5 x 106 egység. Vizes kálium-penicillin G oldatokat készítünk, és a recirkulációs rendszert az 1. példa szerint működtetjük. A használt kálium-penicillin G 96,7%-os tisztaságú, az oldat térfogata 50 liter, az eljárás hőmérséklete 37— 39 °C, a pH 7,8—8,0, az öblítőrendszer 20 liter. A II. táblázat tartalmazza a nyert adatokat. II. táblázat Ciklus 1 2 *1) 4 Kálium penicillin G (kg) 2,0 Nyomásesés az ágyon (atm) 3,0 2,0 3,0 Kezdet 1,2 2,0 3,9 2,2 Vég Recirkulációs sebesség, liter/perc 1,8 3,1 4,5 3,1 Kezdet 25 26 22 25 Vég 24 23 20 24 Reakcióidő óra/mól 0,77 0,78 0,97 0,87 Konverzió, % 6-APA nyert mennyiség 95 95 96 93 %-ban 93 89 94 90<2> (1) A 3. ciklus után a katalizátorágyat leürítettük, vízzel feliszapoltuk, és újratöltöttük a 4. ciklushoz. (2) Nyert izolált 6-APA 91%. Az Escherichia coli ATCC 9637 sejteket tartalmazó penicillinaciláz megfelelően helyettesíti a Proteus rettgeri sejteket az átalakítás során. A penicillinacilázt termelő mikroorganizmus-sejtekből, például a Proteus rettgeri ATCC 31052 és Escherichia coli ATCC 9637 törzsekből izolált és a 3.925.157 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás alapján immobilizált penicillinaciláz a fenti eljárásokban azonos eredménnyel használható. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás penicillinek enzimes átalakítására 6-amino-penicillánsavvá, melynek során a penicillin vizes oldatát egy szemcsés immobilizált penicillinaciláz katalizátorral kezeljük 15—45 °C hőmérsékleten és 6,5—9,0 pH-értéken, azzal jellemezve, hogy az oldatot egy, a szemcsés katalizátort tartalmazó, legfeljebb 6 cm vastag ágyon recirkuláltatjuk legalább 0,4 ágytérfogat per perc sebességgel, és a recirkulációt addig folytatjuk, míg a penicillin nagyrésze átalakul a savvá. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
