176462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergolin-származékok előállítására fermentációs úton
3 176462 4 Ennek az eljárásnak az alkalmazása feltételezi, hogy a törzsnek egy meghatározott, ugyancsak örökletes, rögzített tulajdonsága van, nevezetesen az, hogy megfelelő körülmények között az alkaloidák bioszintéziséhez szükséges nagy számú, igen nagy potenciájú spórákat képez, amelynek következtében a tápoldat beoltását, még nagyipari méretekben is, a konídium-spórák szuszpenziójával lehet végezni. Mint ahogyan ez a 150 631 számú magyar szabadalmi leírásból, valamint Amici cikké: bői [lásd: Appl. Microbiology 18, 464-468 (1969)] világosan kivehető, pontosan ez a tulajdonság teljesen vagy csaknem teljesen hiányzik a szaprofitikusan tenyésztett ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidákat képező ismert Claviceps purpurea törzsekből. Ennek következtében az oltóanyagot szilárd táptalajon közbenső szaporításnak kell alávetni, és az így kapott micéliumot az előtenyészet nagyipari berendezéséhez steril körülmények között kell homogenizálni, ami igen kedvezőtlen feltételeket teremt. Az említett irodalmi forrásokból az is kitűnik, hogy ezeknél az ergotoxin-képzőknél a fermentációs eljárás befejeztéig a sejtekben képződött ergotoxinnak csak csekély része vándorol a sejtfalon át az ezt körülvevő vizes tápközegbe. Ennek megfelelően a képződött alkaloidák teljes kinyeréséhez külön fel kell dolgozni mind a tenyésztési szűrletet, mind a micéliumot. A szubmerz tenyésztés során az anyarozsalkaloidák bioszintézisére képes törzsek rendszerint nagy mennyiségű pigment- és ballasztanyagot képeznek, ennek következtében nagyon komplikált eljárásmódok szükségesek a feldolgozáshoz, amennyiben a kitermelési százalékok nem kielégítőek. Az 1 158 380 számú Nagy-Britannia-i szabadalmi leírás szerint a tenyésztési szűrletet 9-es pH-nál kloroformmal extrahálják, a kapott extraktumot vizes borkősav-oldattal extrahálják és ezt az extraktumot egyesítik a hasonlóan komplikált módon kapott és tisztított micélium-extraktummal. Az egyesített extraktumot bepárolják és hexánnal leválasztják a nyers alkaloida-bázisokat. A kapott csapadékból jégecettel, metanollal és kénsavval eltávolítják az ergotamin-szulfátot, a maradékot bepárolják, vízben oldják és a vizes oldatot 9-es pH-nál újból kloroformmal extrahálják. A koncentrált kloroform-extraktumot 100-szoros mennyiségű szilikagélen kromatografálják és végül az így tisztított ergokriptint benzolból izolálják bázis alakjában. Egy további kromatográfiás frakcióból, bepárlás és a maradék vizes acetonos oldása után további ergotamint izolálnak. Az alábbiakban részletesebben ismertetett új Claviceps purpurea törzs segítségével végzett tenyésztések esetében az anyarozsalkaloidák izolálására' leírt általános eljárások (1 158 380 számú Nagy-Britannia-i szabadalmi leírás és a 3 485 722 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) nem vezettek eredményhez. Elsősorban az okozott zavart, hogy a kloroformos extrakciónál a tenyésztési szűrlet, valamint a micéliumextraktum is könnyen képezett emulziót. Ugyancsak nem sikerült az ergotoxint kristályos bázissá alakítani, és a fenti szabadalmi leírásokban a nem-kristályos tr tiszta- vagy nyersalkaloid-koncentrátumokra leírt kitermelési százalékokat sem lehetett elérni. A 41 967 számú Német Demokratikus Köztársaság-beli szabadalmi leírás értelmében a csekély alkaloida-koncentrációjú tenyésztési folyadékokból nyert extraktumot, amely egymás mellett tartalmaz ergotoxint és ergometrint, növekvő polaritású eluálószerekkel kromatografálják és az egyes alkaloidákat önmagában ismert módon kristályosítják. Általában ismeretes azonban, hogy a metanol-tartalmú oldószerekkel végzett eluálás olyan ergometrint szolgáltat, amelynek túl nagy, azaz nem kielégítő a pigment-tartalma. Az ergotoxin nyomás alatti hidrogénezését a 883 153 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás és a 470 573 számú kanadai szabadalmi leírás szerint végzik nagy aktivitású palládium, illetve hordozóhoz kötött palládium katalizátor segítségével. Az ilyen eljárás a hidrogénezett termék nem-kívánatos pigment-tartalmához vezet, ami nyilvánvalóan a nem-kielégítő szelektivitásnak a következménye, és ezért további tisztítási lépések szükségesek. A találmány szerinti eljárás célja, hogy megjavítsa az ipari eljárást ergolin-származékok, elsősorban az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidák és a 9,10-dihidroalkaloidák, valamint ergometrin előállítására. Azt találtuk, hogy egy új törzs, nevezetesen a Claviceps purpurea (Fr.) Túl., amely szintetikus, szervetlen nitrogén-tartalmú vegyületeket, cukrot, szerves savakat és a szokásos szervetlen sókat tartalmazó táptalajokban szubmerz tenyésztés során képezi az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidákat, ergometrint, valamint további ergolin-származékokat, egyrészt ipari szempontból igen előnyös alkaloid-szintézist tesz lehetővé, másrészt szilárd vagy folyékony tápközegeken, meghatározott körülmények között a fermentáció-technikai célok szempontjából különösen előnyös mennyiségű, nagy potenciájú, alkaloid-szintézishez alkalmas spórákat képez. Ezenkívül a micéliumot körülvevő fermentációs közeg tartalmazza a képződött ergotoxin nagy részét és az ergometrin gyakorlatilag teljes mennyiségét. Továbbá azt találtuk, hogy ha az új Claviceps purpurea törzs tenyésztési folyadékot szűrjük, és víz hozzáadása nélkül, vagy célszerűbben azonos térfogatú vízzel történő hígítás után a tenyésztési folyadék pH-ját ammóniumhidroxid-oldattal 8-9-re állítjuk be, úgy e tenyésztési folyadékot gyakorlatilag teljesen (kimerítően) és a zavaró emulzióképzés nélkül extrahálhatjuk karbonsav-alkilészterekkel, előnyösen etilacetáttal, illetve a hígítási variáns esetében végezhetjük az extrakciót klórozott szénhidrogénekkel is, előnyösen metilénkloriddal. A hígítási variáns esetében ilyenkor a ballasztanyag kívánt csökkentésén kívül meglepő módon emelkedik a tenyésztési szűrletben levő ergotoxin mennyisége. A szűrés után kapott biomasszát, a fennmaradó alkaloid-tartalomtól függően acetonnal extraháljuk, a szűrés után kapott zavarosság-mentes extraktu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
