176307. lajstromszámú szabadalom • Eljárás juh adenovírus által okozott betegségek elleni védekezésre használható inaktivált bivalens vakcina előállítására
3 176307 4 járvány során izoláltuk (Magyar Állatorvosok Lapja, 1976. 31. 629). Ugyancsak egy hazai járvány során izoláltuk a GY/14 jelzésű törzset. Ez az 1-es típusú juh-adenovírus törzsekhez tartozik (Zbl. Vet. Med. B., 1976. 23. 320; Magyar Állatorvosok Lapja. 1976. 31.629). A vírustörzsek az alábbiak szerint azonosíthatók: elektronmikroszkópos vizsgálatok során a vírustörzsek partikulái ikozahedrális szimmetriát mutatnak, külső peplonjuk nincs, ármérőjük átlagban 75 nanométer. A virionok úszósűrűsége céziumkloridban végzett ultracentrifugálás során 1,34 g/cm3. A vírusok a pH 3-as közeget, a zsíroldószerekkel és a nátriumdezoxikoláttal végzett kezelést titerveszteség nélkül elviselik. A virionok kettős szálú DNS-t tártál- 15 maznak. A vírusok jól replikálódnak számos emlős eredetű szövetféleségen, így többek között bárányvesén, bárányherén, boíjúvesén, borjúherén és sertésvesén. A fertőzött sejtekben sejtmagzárványokat képeznek. Mind az ORT/111, mind a GY/14 vírustörzs 20 a Mastadenovirus genusban az emberi adenovírusokkal közös szolubilis antigénnel rendelkezik. Ezt többek között a komplementkötési próbával és az agar-gél precipitációs próbával vizsgálhatjuk. A vírusok egymástól való elkülönítésére a vírussem- 25 legesítési próba alkalmas (Magyar Állatorvosok Lapja. 1976. 31.629; Bélák S.: A juh-adenovírusok tulajdonságai, kandidátusi értekezés, Budapest. 1978.), amely nyúlban termelt immunsavók segítségével a következő eredményt adta: Vírusok Immunsavók ORT/111 GY/14 Magnézium-szulfát 2,02 g Dinátrium-hidrogén-foszfát 1,4 g (2 H2 0) Glükóz 10 g Fenolvörös 10 ml 5 Nátrium-hidrogén-karbonát 16,8 g Laktalbumin 50 g A tenyésztést célszerűen a szövet teljes széteséséig folytatjuk. Ekkor a tenyészetekhez adjuvánst adunk és azokat az adjuvánssal alaposan összekeverjük. Bár- 10 mely ismert adjuvánst használhatjuk az eljáráshoz, előnyösen azonban az alumíniumhidroxidgélt vagy az alumíniumhidroxidgél és szaponin keverékét használjuk. Az így elkészített oltóanyagot azután inaktiváljuk. Ehhez a művelethez használhatunk bármilyen ismert inaktiválószert. Inaktiválószerként előnyösen formaldehidet vagy béta-propiolaktont használunk. Az így kapott használatra kész vakcinához kívánt esetben hozzáadhatunk egy tartósítószert, előnyösen nátriumazidot. Az így kapott vakcinát fertőzésnek kitett állatok beoltására, valamint vemhes anyajuhok beoltására használhatjuk. A vakcina adagja 2 ml, melyet az izomba előnyös oltani. A vakcinát, mint később részletezzük legelőnyösebb oly módon használni, hogy az oltást megismételjük. Igen hatékonyan védhetjük a hízóbárányokat, ha azokat hizlaldába állítás előtt oltjuk be a vakcinával. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg 30 közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa ort/ii; GY/14 1 :1024 1 : 1024 35 A fentiekből kitűnik, hogy a két vírustörzs egymással nem rokon. Ennek megfelelően egymással szemben védelmet sem alakítanak ki. Mivel a járványokat tapasztalatunk szerint általában e két vírus idézte elő, az oltóanyaghoz szükségesnek láttuk mindkét vírus felhasználását. A vírusokat juhmagzat vagy egy-két hetes bárány veséjéből készített sejttenyészetben szaporítjuk. A sejttenyészeteket 37 °C-on 7,2-7,4 pH tartományban szaporítjuk és tartjuk fenn. A sejtek szaporításához tápfolyadékként Hanks oldatot vagy Earle oldatot használunk. A Hanks oldat összetétele a következő: 10 liter 2-szer desztillált vízhez: Nátrium-klorid Kálium-klorid Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát Kalcium-klorid Magnézium-szulfát Glükóz Laktalbumin Fenolvörös Nátrium-hidrogén-karbonát Az Earle oldat összetétele a következő: 10 liter 2- szer desztillált vízhez: Nátrium-klorid 68 g Kálium-klorid 4 g Kalcium-klorid 2,6 g (2 H2 O) 80 g 4 g 0,6 g 1,52 g (12 HjO) 1,2 g (2 H20) 2 g (7 H20) 10g 50 g 10 ml 7g 40 45 50 55 60 65 ORT/111 jelzésű, illetve GY/14 jelzésű juh adenovirus törzset juhmagzat veséjéből készült egyrétegű sejttenyészeten szaporítunk. Tápfolyadékként 10% foetál borjúsavót tartalmazó Hanks oldatot, fenntartóként szintén Hanks oldatot használunk. A tápfolyadékként használt Hanks oldatot 10%-foetális borjúsavóval egészítjük ki. A vérsavó újszülött, colostrummentes borjakból származik (előnyösen a Phylaxia által forgalmazott és használt „colostrummentes borjú vérsavó”). A fenntartó folyadékként használt Hanks oldathoz nem adunk borjúsavót. A vírusokat 2000 ml-es Roux-palackokban szaporítjuk a 100%-os sejtkárosító hatás megjelenéséig. Ekkor a palackokat lefagyasztjuk, majd felolvasztás után centrifugálás nélkül használjuk fel a továbbiakban. A vakcinát ezután oly módon adjuváljuk, hogy a vírustenyészethez 3% alumíniumoxidot tartalmazó alumíniumhidroxid-gélt adunk és a vírustenyészetet szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük az adjuvánssal. Ezután az adszorbeált vírust szobahőmérsékleten 24 órán át kezeljük 0,15%-os vizes formaldehid-oldattal. Az így kapott vakcinához azután tartósítószerként 0,05% nátriumazidot adunk és a vakcinát üvegekbe töltjük. 2. példa ORT/111 jelzésű vírustörzset és GY/14 jelzésű vírustörzset 2 hetes bárány veséjéből készült egyrétegű 2
