176225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükagon kinyerésére az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból
3 176225 4 kivonat bepárlása, kicsapás nátrium-kloriddal, izoelektromos ponton történő kicsapás, többszöri alkoholos frakcionálás, derítés, kristályosítás cinkkel acetát-pufferból, mosás az amorf frakció eltávolítása céljából és a kapott cink-inzulin szárítása. Az amorf frakció mintegy 4 súly% glukagont és 7 súly% inzulint tartalmazott. Általában az amorf anyag kinyerése körülbelül ll-22mg/kg hasnyálmirigy. A glukagon-előállítás lépései: frakcionálás pH 6,7-nél, acetonos frakcionálás, frakcionált kicsapás pH 4,3-nál, két frakcionált kicsapás pH 2,5-nél és két kristályosítás karbamid-glikoll pufferből, pH 8,6-nál. A kristályos glukagon kinyerése a száraz amorf anyag glukagontartalmának mintegy 20 súly%-a volt, ami körülbelül 0,088-0,176 mg glukagon/kg hasnyálmirigy kitermelésnek felel meg. A cink-inzulin citrát pufferből való közbenső kikristályosításának a bevezetése - a 2 626 228 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint - hathatósan csökkentette a marha-hasnyálmirigyből kiinduló inzulin-előállítás szükséges lépéseinek a számát. Míg megközelítőleg azonos mennyiségű amorf frakció képződött a mosási művelet folyamán, mint a régebbi eljárásnál, addig az amorf frakció glukagontartalma lecsökkent körülbelül 0,2 sűly%-ra. Mint kiderült, a glukagon a citrát-pufferben maradt vissza a közbenső kristályosítás folyamán. A glukagont a citrát-pufferből cink-felesleggel való kicsapással nyerték ki, majd a cink eltávolítása céljából sós kicsapás és két, pH 5,1-nél illetve 5,6-nál végzett kicsapás következett. A citrát pufferből kinyert nyers glukagon körülbelül l,77~2mg/kg hasnyálmirigy, a tisztított glukagon kinyerése pedig mintegy 0,22—0,66 mg/kg hasnyálmirigy. A cink kicsapószer használata megnehezítette a cink tökéletes eltávolítását, és növelte a végső tisztított glukagonba átvitt inzulin mennyiségét. A 3 715 345 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, melynek során az ecetsavas vizes-alkoholos hasnyálmirigy-extraktumot 7—8 pH-értékre állítják, és a kapott oldatot szulfonált makroretikuláris alkálifém-formájú, sztirol-divinilbenzol kopolimerre viszik fel, majd a gyantát megfelelő pufferrel mossák, a glukagont a gyantáról megfelelő vizes bázissal eluálják, az eluátum pH-ját 2 és 3 közé állítják, majd a glukagont nátriumklorid hozzáadásával csapják ki. A csapadékot kiszűrik, és a sóformájú szüredék szolgál a standard glukagon tisztítási lépések kiindulási anyagául. Ilyen tisztítási eljárások a leírásban ismertetett Staub-féle módszerek. A fenti szabadalmi leírás azonban nem glukagonnak inzulintól való elválasztására, hanem inzulin és az ahhoz igen közel álló egyéb proteinek, például proinzulin, dezamidoinzulin, egymástól és a hasnyálmirigy-extraktumban levő összes más proteintől való elválasztására vonatkozik. A glukagon az eljárás során melléktermékként keletkezik, és a Staub-féle tisztításnak alávetve minimálisan is a következő lépéseket kell elvégezni. 1. acetonos frakcionálás, 2. frakcionált kicsapás pH = 4,3 értéken, 3. legalább két frakcionált kicsapás pH = 2,5 értéken, és 4. legalább két átkristályosítás pH = 8,6 karbamid-glicin pufferből. Általánosságban a nyers hasnyálmirigy-extraktumban levő proteinek savas illetve bázikus jellegük szerint csoportosíthatók. Az inzulin és inzulin-jellegű proteinek savas jelleműek, és a nyers hasnyálmirigy-extraktumnak csak kis részét alkotják. Az összes fennmaradó protein, beleértve a glukagont is, bázikus. Ezért a korábbi irodalmi források sze rinti módszereknél, melyeknél kopolimert használnak, az összes bázikus protein e kopolimerhez kötődik, mint a fenti Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerinti eljárásban is, amely lényegében ioncserélő folyamat, mely szelektíven eltávolítja a proteineket a nyers hasnyálmirigy-extraktumból. Az irodalomban található vizes bázissal és sóval végzett kicsapásos módszer egyszerű izolálási lépés, és glukagonon és bármely más bázikus proteinen egyaránt alkalmazható. Bár a nyers extraktumban levő glukagon gyakorlatilag teljesen kiválik a vizes bázis hatására, a sóval kicsapott protein glukagon tartalma általában 5%-nál kisebb. így a fenti szabadalmi leírásban szereplő eljárás hozzávetőlegesen csak a találmány szerinti eljárással izolált glukagon az izolálási lépés során kapott protein összmennyiségének csupán kis részét jelenti. A glukagon elválasztás kiindulási anyagául a jelen találmány egységes kiindulási anyaga előtt, azaz a lúgos kristályosítás felülúszójának használata előtt, az egyetlen glukagon-forrás egy amorf alapanyag volt. Ez jól látható a Staub-féle módszereknél, ahol cink-inzulin-kristályok váltak ki és glukagont tartalmazó amorf réteg maradt vissza. Ezt a réteget manuálisan kellett eltávolítani a cinkkristályok felületéről a glukagon-kiindulási anyag nyerésére. Az amorf bázist sertés- vagy szarvasmarha pankreáz-extraktumból nyerték. A hiperglikémiás faktort pH = 7 értéken elbontották, majd a kicsapódott glukagont tisztították és szálképzéssel elválasztották. 1961-től, mint azt a leírás bevezető részében is leírtuk, az inzulin cinkkel végzett kristályosítását citrátpuffer jelenlétében végezték. Ezen módszer csak sertéspankreáz esetén volt alkalmazható. A glukagon a cink-inzulin kristályok kicsapódása után a citrátos felülúszóban maradt, azonban az inzulinsó-kristályok is tartalmaztak glukagonkristályokat, tehát az elválasztás nem volt kielégítő. Az eljárás nem kielégítő tisztasága a sertéspankreázban található szennyezésekből adódott. A hasnyálmirigy-kivonatokon végzett vizsgálatok szerint az inzulin előállításánál kapott különböző savas-alkoholos kivonatok 8,8—13 mg glukagont tartalmaznak hasnyálmirigy kilogrammonként. A kivonatcjjc bepárlása és zsírtalanítása után a glukagonttartalom lecsökken 3,3—4,4 mg-ra hasnyálmirigy kilogrammonként. Azonban - mint fentebb említettük - ennek a mennyiségnek csak mintegy 25- —50 súly%-a nyerhető ki tisztán, függően a használt kiindulóanyagoktól. Az eljárás glukagon-forrása a 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban leírt inzulin-előállítás lúgos kristályosítási lépésénél kapott felülúszó. Ez a felülúszó 7,2— 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
