176225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükagon kinyerésére az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból
5 176225 6 —10,0pH-jú és 0,2—1,0 mól kation-koncentrációjú vizes oldat, és a benne oldott fehéije mintegy 1—10%-a inzulin és 0,2—1,5%-a glukagon, függően az inzulin-előállításhoz használt hasnyálmirigy eredetétől. Például szarvasmarha-hasnyálmirigy esetén a lúgos kristályosításkor kapott felülúszó fehérjetartalmának általában 5-10%-a inzulin és 1,0—1,5%-a glukagon, sertés-hasnyálmirigynél a felülúszó fehéije általában mintegy 1—2% inzulint és 0,2—0,3% glukagont tartalmaz. Megjegyzendő azonban, hogy a tényleges kitermelés sarzsonként széles határok között változhat a glukagon enzimes lebomlásra való hajlama miatt. A mellékelt rajz a találmány előnyben részesített kivitelének folyamat ábrája. A rajz a találmány szerinti eljárás és az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítási lépés kapcsolatát is bemutatja. A glukagontartalmú fehérjének a lúgos kristályosításakor kapott felülúszóból való izolálása bármilyen ismert módszerrel végrehajtható. Például a felülúszó pH-ját 3,0-ra állítjuk be és 20% (súly/térfogat) nátrium-kloridot adunk hozzá a glukagon és más fehérjék kicsapása céljából. A kicsapást feles mennyiségű cink-kloriddal is végrehajthatjuk pH 6,0-nál. Harmadik lehetőség az izoelektromos ponton való kicsapás. Ismét más módszer az ioncserélő kromatográfia. A glukagontartalmú fehérjét a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóból előnyösen izoelektromos ponton történő kicsapással vagy ioncserélő kromatográfiával választjuk el. Általában az izoelektromos ponton való kicsapáshoz a felülúszó pH-jának körülbelül 4,2—6,6-nak kell lennie. Előnyösen körülbelül 4,6—5,2, legelőnyösebben körülbelül 4,7— —5,0 pH-tartományt használunk. Mivel a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó pH-ja körülbelül 7,2—10, ezért a felülúszót a kívánt pH eléréséhez meg kell savanyítani. A megsavanyítás glukagonnal nem reagáló vagy azt nem károsító szervetlen vagy szerves savak híg oldatának egyszerű hozzáadásával történhet. Alkalmas sav például a sósav, foszforsav, hangyasav, ecetsav, propionsav és hasonlók. A sósavat részesítjük előnyben. Előnyösen alkoholt — körülbelül 20 térfogat%-ig — adhatunk a felülúszóhoz, hogy csökkentsük a glukagontartalmú fehérjének a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóban való oldhatóságát. „Alkohol” alatt 1-4 szénatomszámú telített, alifás egyértékű alkoholt értünk. Előnyösen az alkohol metil-, etil-, propil- és izopropil-alkohol. Leginkább az etil-alkoholt részesítjük előnyben. Alkohol használata esetén az alkoholt általában megsavanyítás előtt adjuk a felülúszóhoz. Amikor a felülúszót a kívánt pH-ig megsavanyítjuk, gyorsan megindul a glukagontartalmú fehéije kiválása, általában néhány perc alatt. A teljes kicsapódás biztosítása érdekében az oldatot állni hagyjuk, szokásosan szobahőmérsékletnél nem magasabb hőmérsékleten. Előnyösen az oldatot körülbelül 3-10°C-ra lehűtjük. Bár a kicsapódás mintegy 24 óra alatt általában teljesen végbemegy az elegyet károsodás nélkül bármeddig állni hagyhatjuk. Teljes kicsapódás után a csapadékot — a továbbiakban „csapadékot” — alkalmas ismert módszerrel, mint centrifugálással vagy szűréssel izoláljuk, általában a szűrést részesítjük előnyben. A kapott csapadékot nem kell mosni vagy szárítani, bár szükség esetén ilyen lépéseket alkalmazhatunk. A glukagontartalmú fehérjét a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóból ioncserélő kromatográfiával is kinyerhetjük. Az ismert ioncserélő eljárások közül a 3 715 345 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban leírt különösen hatásos módszert részesítjük előnyben. Az ioncserélő kromatográfia során a glukagontartalmú oldatot alkálifém-formájú szulfonált makroretikuláris sztirol/divinil-benzoi kopolimer gyantán bocsátjuk át pH 7—8-nál. A gyantán adszorbeált glukagont híg lúggal, mint 0,1 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk. A glukagont tartalmazó eluátumot pH 2,5-re állítjuk be és a glukagont standard „só-kicsapási” módszerrel izoláljuk. A képződött glukagontartalmú csapadékot az inzulin-fehérjéktől így nagyrészt elválasztottuk, de a csapadék még tartalmaz más, nem-glukagon anyagokat. A lúgos kristályosítás során kapott felülúszót a 3 715 345 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás eljárása szerint kezelve inzulintartalmú eluátumot és glukagontartalmú sót kapunk. Az inzulintartalmú eluátum — szükség esetén — visszavezethető az inzulinelőállító folyamatba. A glukagontartalmú sót a további feldolgozáshoz feloldjuk, kényelmi okokból az oldat pH-ját és fehérje-koncentrációját a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó pH-jával és fehérje-koncentrációjával megközelítőleg azonosra állítjuk be. Mint fentebb említettük, a glukagont a többi fehérjétől legelőnyösebben szálképző eljárással választhatjuk el. Általában a glukagon-szálakat savas vizes oldatban hozzuk létre. Szokásosan a glukagontartalmú fehérjét mintegy 2,7 pH-jú savas vizes közegben oldjuk. Bár általában mintegy 1,5— —2,7 pH-tartományt használhatunk, előnyben részesítjük a 2,0—2,5 pH-tartományt. Bár a megsavanyításhoz mindazok a savak alkalmasak, amelyek a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó izoelektromos ponton való kicsapása előtt használhatók, mégis ismét előnyben részesítjük a sósavat. Sósav esetében azonban tartósítószert, mint fenolt kell alkalmazni, szokásosan körülbelül 0,2% (súly/térfogat) töménységben. A glukagontartalmú fehérjét előnyösen 0,2% (súly per térfogat) fenolt tartalmazó 0,01 n sósavban oldjuk. Az oldatban a glukagontartalmú fehéije koncentrációja általában körülbelül 2,5-30 mg/ml. Előnyös az 5-20 mg/ml, legelőnyösebb az 5-10 mg/ml koncentráció-tartomány. Úgy is eljárhatunk, hogy a szálképződés megindításához vízoldható szervetlen sót adunk a savas glukagontartalmú fehéijeoldathoz. A „vízoldható” sók közé tartoznak azok a szervetlen sók, melyek az alább leírt koncentrációkban használva vízben oldhatók. Mivel a szervetlen sók elsődleges hatása a szálképződést megindító kisózó hatás, ezért a szervetlen só kiválasztása nem kritikus. Mégis a gyakorlatban radioaktív, mérgező vagy színes sók, vagy olyanok, amelyek oxidálószerek, redukálószerek, vagy erős savak vagy bázisok, érthető okokból nem kívánatosak. így az alkalmas szervetlen sók közé 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
