176180. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigénkészítmények előállítására
5 176180 6 I. Táblázat Antigén Adag Egerek Vírus tüdő-titrálás száma (10g10) PR8 szubegységek 5 Mg i.p. 1. 2. 3.-4,21 4. . 5. 6. PR8 szubegységek 50 pg 7. i.p. 8.-3,39 9. 10. Liposzómák 11. (PR8 szubegységek) 12.-3,4 az alábbi liposzóma 5 Mg 13. 10-szeres hígításával i.p. 14. készített szuszpenzió 15. Liposzómák 16. (PR8 szubegységek) 50 Mg 17.-1,76 0,5% lipoid i.p. 18. (meghatározható vírus-növekmény 19. nincs, kivéve 1 egér 20. tüdejének 1/8-át) 1. példa 0,25 g/liter káliumklorid, 0,25 g/liter káliumdihidrogénfoszfát és 1,4375 g/liter dinátriumhidrogénfosz-A) Influenza-vírus szubegységeinek fát. az előállítása 35 B) Liposzómák előállítása Nagymértékben tisztított [J. J. Skehcle és G. C. Schield módszere szerint: Virology, 44, 396-408 2,5 mg dicetilfoszfátot és 22,5 mg lecitint fel(1971)] PR8 influenza-vírust (12mg vírus prote- oldunk mintegy 50 ml kloroformban. Az oldatot in/ml) elkeverünk annyi nem-ionos mosószerrel 40 Buchi-elpárologtató segítségével enyhe vákuum alatt (Nonidet NP 40), hogy a keverék végső mosószer- szárazra pároljuk. 5 ml vírusos antigén készítmény -koncentrációja 5 térfogat% legyen, és ezt rárétegez- PBS-es oldatát hozzáadjuk a lombik tartalmához, zük 11 ml céziumklorid-grádiensekre, amelyek és a lombikot kézzel és mechanikus úton addig 24-45 súly/térfogat% céziumkloridot (0,05 mólos keverjük, míg a lipoid szuszpendálódik a folyadéknátriumfoszfát-pufferben, pH = 7,0) tartalmaz, vala- 45 ban. A keveréket fiolába helyezzük és 1,5 perces mint 0,3 ml szacharóz-felsőréteget. A gradienseket ultrahangos kezelésnek vetjük alá, 1 em-es mintákat 100 000 g-n centrifugáljuk 3 órán át, vagy még és 8 m amplitúdót alkalmazva, tovább, majd frakcionáljuk és a frakcióknak megvizsgáljuk a hemagglutinációs aktivitását. A nagy C) Védőhatás-próba egereken aktivitású frakciókat összeöntjük, majd foszfáttal 50 pufferolt nátriumklorid-oidattal (PBS) szemben vá- A liposzóma-készítményeket megvizsgáljuk védőkuumdialízisnek vetjük alá, ezután rárétegezzük egy hatás szempontjából. második grádiensre: 20—60 sűly/térfogat%-os szacha- 20 egeret négyszer 5-ös csoportokba osztottunk, róz-PBS-oldatra, és 100 000 g-n 16 órán keresztül két csoportot intraperitoneálisan injekcióztunk az centrifugáljuk. A frakcióknak ismét megvizsgáljuk a 55 LA) példa szerinti vírusos szubegységekkel, az hemagglutinációs aktivitását, a nagy aktivitási frak- egyiknek 50 /ag/0,25 ml-t, a másiknak 5 jug/0,25 ml-t dókat megint összeöntjük és PBS-el szemben vá- adtunk. A harmadik és negyedik csoportot hasonkuumdializáljuk. A végső oldat protein-koncent- lóan kezeltük az l.B) példa szerinti liposzómákkal, rádója 1,76 mg/ml és hemagglutinációs aktivitása az egyiknek 50 ítg/ml/0,25 ml-t, a másiknak mintegy 106 HAÜ/ml (HAU = hemagglutinációs ak- 60 5 jug/0,25 ml-t adtunk. tivitási egység). Iiposzómák előállítása céljából a 10 nappal később beoltottuk az egereket ugyanszubegység-keverék végső protein-koncentrációját azon törzs élő vírusaival és a tüdőjüket két nappal beállítjuk 200 pg/ml-re. később kioperáltuk. A tüdőket homogenizáltuk és A foszfáttal pofferoíí nátriumklorid-oldat (PBS) szonikáltuk, hogy felszabadítsák a meglévő vírusoösszetétele a következő; 10g/liter nátríumklorid, 65 kát és a kapott szuszpenziót megvizsgáljuk „allan-3
