176180. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigénkészítmények előállítására
176180 tois-on-shell” tenyészettel Fazekas de St. Groth és White eljárása szerint [Journal of Hygiene 56, 151 (1958)]. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk Össze. 50pg/os liposzómához kötött szubegységek 5 megfelelő védelmet biztosítottak az immunizációt követő 10 nap múlva a homológ vírusfertőzéssel szemben. Ennél az egér-csoportnál csak az egyik egérnél tapasztaltunk a tüdőn nyomnyi vírus-növekményt. Hasonló védelmi szintet nyújtott az 5 pg/os 10 liposzóma-adag is, mint az 50 pg/os, csak szubegységeket tartalmazó adag, illusztrálva, hogy a liposzóma-anyagnak tulajdonítható a tízszeres védőhatás. 2. példa A) 2,5 mg dicetilfoszfátot és 22,5 mg lecitint feloldunk mintegy 50 ml kloroformban. Az oldatot 20 az 1. példa szerint szárazra pároljuk és szintén az előbbiek szerint hozzáadunk annyi foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldatot, hogy a lipoid-koncentráció 16,6 pmól/ml legyen. Ezt a keveréket ultraszonikus fürdőben 1,5 órán 25 keresztül szonikáljuk 50 KHz frekvencián. B) A kapott készítményhez l.A) példa szerinti influenza-vírus szubegységeket adunk 200 pg/ml koncentrációig. Ezt a keveréket azután ultraszonikus fürdőben további 15 percig szonikáljuk 30 50 KHz frekvencián. C) A 2.A) példa szerinti mikroszkopikus testek negatív festési technikával végzett elektronmikroszkópos vizsgálata szerint, e testek legnagyobb része kis egylamellás szerkezetű, amely enyhén szennye- 35 tett nagyobb multilamellás szerkezetekkel (azaz lipo szómákkal). A lípoid-korongok legnagyobb része 50—100 nm méretű. D) A 2.B) példa szerinti szubegységek C-vel azonos vizsgálata csak a tipikus csillag és kerék-formákat mutatja, amelyek a hemagglutinin és a neuramidináz szubegységeknek tulajdonítható. Vírusos membrán nyomát sem lehet találni. E) A fenti B) példa szerinti szubegységek C-vel azonos vizsgálata szerint a szubegységek legnagyobb része az egylamellás testek felületén helyezkedik el, anitől az influenza-vírushoz válnak hasonlóvá. A mikroszkopikus testek legnagyobb részénél elsősoiOan a hemagglutinin szubegységek tűntek elő, de néhány területen láthatók a hozzákapcsolt neuramidináz szubegységek is. E mikroszkopikus testek további immun elektronmikroszkópos vizsgálata azt mutatja, hogy a hiperimmun influenza A antiszérum hozzáadása következtében a testek nagy komplexekké aggregálódnak. 3. példa Etanol-liposzómák előállítása 30 mg lecitin kloroformos oldatát részleges vákuum alkalmazásával rotációs elpárologtató készüléken szárítjuk. Ezután hozzáadunk 2 ml etanolt a száraz lipoid feloldása céljából és a kapott oldatot felszívjuk 27-es méretű tűvel ellátott 2 ml-es injekciós fecskendőbe. 30 ml 0,16 mólos káliumklorid-oldaton keresztül 1 órán át nitrogénáramot buborékoltatunk, majd a fenti tűvel az oldatba fecskendezzük a lecitin etanolos oldatát. A kapott liposzóma-készítményt ultraszűrés segítségével mintegy 3ml-re töményítjük, PM 30-as membránnal ellátott Amicon modell 52 ultraszűrőcellát alkalmazva [I.B.B. Acta, 298, 1015-1019 (1973)]. II. Táblázat Antigén Adag Egerek Vírus tüdő-titrálás száma (10 g10) Középérték Átlagérték 42 pg X31 szubegység 0,25 ml-ben 1.-1,75-1,85 alkohol 2.-1,75 ±0,22 liposzómán 3.-1,75 4.-1,75 5.-2,25 42 pg X31 42 pg 16.-3,31-2,95 szubegység 0,25 ml-ben 17.-2,63 ±0,78 PBS-ben 18.-3,88 19.-3,13 20.-1,81 nem immunizált 21.-4,06-4,42 22.-4,50 ±0,21 23.-4,50 24.-4,56 25.-4,50 4
