176133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szer az MB-kreotinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék- mintákban
11 176133 CK” készítmény alkalmazásával) meghatározzuk a megmaradó kreatinkináz-aktivitást. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja: A kreatinkináz-izoenzimek megmaradó aktivitása gátló hatású anti-humán-MM-kreatinkináz jelenlétében történő inkubálás után (mindenkor 5 meghatározásból kapott átlagértékek ± 1 s; s=standard eltérés): Izoenzim A hozzáadott izoenzim aktivitása Megmaradó aktivitás inkubáció után (egyscg/liter) MM-kreatinkináz 98 ± 1,9 1043 ±22 0,3 ±2,1 0,5 ±2,5 MB-kreatinkináz 103 ±2,0 410 ±7,8 53 ±1,7 206 ±6,2 BB-kreatinkináz 197 ±3,8 199 ±4,1 A fenti adatok azt mutatják, hogy az MM-kreatinkináz-izoenzim aktivitásának gátlása a mérési pontosságon belül 100%, a BB-kreatinkináz-izoenzimé 0% és az MB-kreatinkináz-izoenzimé (annak megfelelően, hogy 50% M-alegységet tartalmaz) 50%. Ezek az eredmények a hozzáadott izoenzim-aktivitás széles érték-tartományában állandóak. 2. példa I. vizsgálat az MB-kreatinkináz-aktivitás testfolyadékokban történő mennyiségi meghatározására a) A vizsgálati reagens-csomag összetétele Az alábbi Összetételű reagens-csomagot készítjük el a vizsgálat céljaira. (Egy ilyen reagens-csomag 10 aktivitás-meghatározásra elegendő.) A csomag egy palack pufferoldatot, 10 meghatározásra elegendő oldat-menynyiséggel, 10 palack koenzim-enzim-szubsztrátum elegyet és egy palack anti-MM-kreatinkináz reagenst [előállítva a B példa a) bekezdése szerint] tartalmaz. A palackokban levő koenzim-enzim-szubsztrátum elegy összetétele: kreatin-foszfát-dinátriumsó-hexahidrát 27,24 mg glutation, redukált 6,4 mg (vagy N-acetil-cisztein 3,4 mg) adenozin-dífoszfát-dínátriumsó-hexahidrát 1,25 mg nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát--dinátriumsó 1,7 mg adenozin-monofoszfát-dinátriumsó 8,47 mg hexokináz 5 E glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 3 E glükóz 8,32 mg magnézium-acetát 4,52 mg A pufferoldatot tartalmazó palack tartalma : trietanolamin-acetát (vízben) 105 mM A liofilizált antitesteket 2 ml desztillált vízben oldjuk. A kapott antitest-oldatot úgy állítjuk be, hogy az 1000 E/l-ig teljesen gátolja az MM kreatinkináz aktivitását. Igen nagy kreatinkináz-összaktivitású szérumok esetében a szérumot ezért körülbelül lOOQE/l-re kell előzetesen hígítani. A fenti módon készített antitestoldat +4 °C hőmérsékleten legalább 7 napig eltartható. b) Az MB-krealinkináz-aktivitás-meghatározásának kiviteli módja b}) A vizsgálat lefolytatása: Egy reakcióedénybe pipettával bemérünk 0,1 ml szérumot és 0,1 ml antitest-oldatot. Az edény tartalmát jól összekeverjük, 25 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd az így kapott reakcíóelegyből 0,1 ml-t, valamint 2,0 ml pufferoldatot bemérünk egy palackba, amely koenzim, enzim és szubsztrátum elegyét tartalmazza. A palack tartalmát összekeverjük, 25 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd egy küvettába öntjük és 25 °C hőmérsékleten mérjük az extinkciót és ezt követően meghatározzuk az extinkció percenkénti változását, 334,340 vagy 366 nm-en, 1 cm rétegvastagságú oldattal. b2) Az eredmény kiszámítása: A minta fenti módon meghatározott kreatinkináz-aktivitását a) a hígítási faktorral (2) és b) az MB-kreatinkináz-hibridfaktorral (2) kell szorozni (a vizsgálatban csak az MB-kreatinkináz-B-alegységeinek aktivitását mértük). A kapott percenkénti extinkció-különbségekből (Extinkciókülönbség/perc) átlagértéket képezünk és ezt behelyettesítjük a megfelelő számítási képletbe: mérés 334 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás— Extinkciókülönbség/perc x 4 x 3500 E/l mérés 340 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc x4 x 3376 E/l mérés 366 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc x 4 x 6364 E/l. 12 3. példa II. vizsgálat az MB-kreatinkináz-aktivitás testfolyadékokban történő mennyiségi meghatározására a) A vizsgálati reagens-csomag összetétele A reagens-csomag 30 aktivitás-meghatározásra elegendő. A csomag egy palack pufferoldatot tartalmaz 30 meghatározásra elegendő oldat-mennyiséggel, továbbá 30 palack liofilizált elegyet, amely koenzimet, enzimet, szubszírátumot és az la) példa szerinti anti-MM-kreatinkináz-reagenst tartalmaz. A pufferoldatot tartalmazó palackban levő trietanolamin-acetát mennyisége megfelel a 2a) példában megadott mennyiségnek. A koenzim, enzim,'szubsztrátum és anti-MM-kreatinkináz-elegyet tartalmazó egyes palackok a három első komponens tekintetében ugyancsak megfelelnek a 2a) példában megadott összetételnek és emellett további adalékként annyi anti-MM-kreatinkinázt tartalmaznak, amennyi 1000 E/l-ig teljesen gátolja az MM-kreatinkináz-aktivitást. b) Az MB-kreatinkináz-aktivitásának meghatározása bt) A vizsgálat kiviteli módja. Egy koenzim, enzim, szubsztrátum és anti-kreatinkináz-MM-clegyét tartalmazó palack tartalmához pipettával hozzámérünk 2,0 ml pufferoldatot és 1,0 ml szérumot. A palack tartalmát összekevertük, 2$ °C hőmérsékleti» inkubáljuk 5 percig, máid egy küvettába öntjük és 25 °C hőmérsékleten 5 percig tnéijük az extink-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
