176133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szer az MB-kreotinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék- mintákban
9 176133 10 alegység esetében úgy aránylik az izoenzim összaktivitásához, mint körülbelül 50:100.) Még ha az ilyen anti* testek alkalmazása esetén talált körülbelül 20% megmaradó aktivitás reprodukálható is lenne, az így kapott értékek túlságosan alacsonyak lennének az MB-kreatinkináz-izoenzim pontos mérésére, minthogy az ilyen alacsony értékek nem mérhetők pontosan, a kreatinkiná2- -összaktivitás pedig már magában a szérumban is viszonylag alacsony. Az idézett it odaírni közleményben leírt gátló antitesteket ennek megfelelően nem is alkalmazták a kreatinkináz-izoenzimeknek a gátlási elven alapuló meghatározására. A találmány szerinti eljárással viszont az MS*kreatinkináz-aktivitás körülbelül 50%-a (tehát körülbelül a B alegység teljes aktivitása) rendelkezésre áll a mérés céljaira. Ez nagy mértékben növeli a módszer elérhető pontosságát és így igen számottevő haladást jelent. A találmány szerinti eljárás igen fontos előnye a gyors kivitelezhetőség. Ez különösen fennáll annak az előnyös kiviteli módnak az esetében amely szerint az MM* és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alegységének gátlását, valamint a megmaradó aktivitás mérését egyetlen műveletben végzik. Ennek a kiviteli módnak az esetében igen rövid idő alatt, például 5-—30, előnyösen 5—15 perc alatt már pontos vizsgálati eredmény áll rendelkezésre a diagnosztizálás céljaira. A találmány szerinti eljárás további fontos előnye az egyszerű kivitelezhetőség. A vizsgálati módszert nagyobb intézetekben vagy klinikákon, a szokásos mechanizált enzimaktivitás-ineghatározó készülékekkel lehet lefolytatni, kisebb intézetekben vagy orvosi laboratóriumokban már egy egyszerű fotométerrel is végrehajtható a meghatározás. Az egyes meghatározások céljaira olyan előre összeállított reagens-csomagok alkalmazhatók, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez szükséges valamennyi reagenst, így például egy szokásos koenzim-enzim-szubsztrátum keveréket a találmány szerinti MM-kreatinkináz-antitesteket és egy puíferoldatot. Az ilyen vagy hasonló vizsgálati reagens-csomagok elkészítése lehetővé teszi az MB-kreatinkináz-izoenzim igen egyszerű módon és a lehető legkevesebb kellékkel kivitelezhető meghatározását. A technika jelenlegi állása alapján nem volt várható, hogy az MB-kreatinkináz-izoenzim meghatározásának problémája egy ilyen egyszerű és gyorsan kivitelezhető eljárással oldható meg, mint a találmány szerinti eljárás, így nem volt előre látható, hogy olyan specifikus antiszérumok állíthatók elő, amelyek ugyan teljesen gátolják az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimekben jelenlevő M-alegység enzim-aktivitását, azonban nem befolyásolják az MB-kreatinkináz-izoenzim B-alegységének az enzim-aktivitását. Csak az ilyen, eddig nem ismert tulajdonságokkal rendelkező antitestek alkalmazása tette lehetővé a találmány szerinti reakció lefolytatását. Meglepő volt az is, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő antitestek szubsztrátumok jelenlétében is megtartják teljes gátló hatásukat. Ez egyáltalán nem magától értetődő. így az irodalom — Ann: N. Y. Acad. Sei., 103. köt. 858—«89. old. (1963) — oly antitesteket ismertet, amelyek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében már nem gátolják 100%-osan az MM-kreatinkmäz-izoenzim aktivitását. Az ilyen tulajdonságokat mútató antitestek teljesen használhatatlanok lennének a találmány szerinti eljárás oly előnyös kiviteli módjainak a lefolytatására, amelyeknél az antitestekkel történő gátlás és a kreatinkfnáz-szubsztrátumok hozzáadása egyidejűleg történt. Az M-aktivitások nem gátolt része félrevezető módon növelné az MB-kreatínkináz-izoenzimre kapott mérési értéket, esetleg egyáltalán jelen nem levő MB-kreatinkináz-aktivitások jelenlétét mutatná és így hamis laboratóriumi vizsgálati eredményeket szolgáltatna a diagnosztizálás céljaira. A találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő antitesteknek az a meglepő tulajdonsága, hogy teljesen gátolják az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének enzim-aktivitását, anélkül, hogy befolyásolnák az MB izoenzim B alegységének az enzim-aktivitását is, továbbá hogy teljes gátló hatásukat az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységével szemben szubsztrátumok jelenlétében is megtartják, lehetővé teszi az MB-kreatinkináz-aktivitásnak az eddig immunológiai módszerekkel teljesen elérhetetlen gyorsasággal és pontossággal történő meghatározását. Ezáltal új út nyílik a gyakorlat számára, az MB-kreatinkméz-aktivitás gyors vizsgálati módszerrel történő meghatározására. Lehetővé válik az is, hogy a beteg személynél a kreatinklnáz-aktivitás megnövekedését mutató laboratóriumi vizsgálati eredményt megkülönböztetően értékeljék abból a szempontból, hogy a vázizomzatnak vagy a szívizomzatnak a megbetegedése illetőleg sérülése áll-e fenn. Ezáltal igen fontos új adatok válnak hozzáférhetőkké a szívinfarktus differenciális diagnózisa (például a tüdőinfarktustól és/vagy a sokk-következményektől való megkülönböztetése), valamint a szív más megbetegedéseinek illetőleg sérüléseinek a diagnosztizálása számára. Ezen túlmenően az MB-kreatinkináz-aktivitáS specifikus és pontos meghatározása alapján megállapítások tehetők a szívizomnak a2 egyéb extfakatdiális betegségi folyamatokban (például mérgezések vagy balesetek esetében) való részvételére illetőleg sérüléseire vonatkozólag, terápiás behatások (például újraélesztés esetén) vagy diagnosztikus behatások (például szív-katéterezések vagy koszorúér-angiográfiák) esetében. Az alábbi példák szemléltetik közelebbről a találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait. A példákban „M” illetőleg „ftiM” a mól/liter illetőleg millimól/liter egységekben megadott koncentrációkat jelenti. A példákban alkalmazandó reagensként említett valamennyi enzimkészítmény és egyéb reagens a darmstadti (NSZK) E. Merck cég és részben más vállalatok által is gyártott, kereskedelmi forgalomban beszerezhető készítmény. 1. példa MM-, MB- és BB-kreatinkináz-izoenzimek gátlása anti-humán-MM-kreatinkináz által Egy, a saját kreatinkináz-aktivitás tekintetében inaktivált humán-szérumhoz tiszta MM-, MB- vagy BB-kreatinkináz-izoenzimet (az E. Merck darmstadti cég által gyártott, kereskedelmi forgalomban levő készítmények) adunk és meghatározzuk az egyes minták kreatinkináz-aktivitását. Ezután 0,1 ml mintához 0,1 ml anti-MM-kreatinkináz-oldatot — előállítva az alábbi B példa a) bekezdése szerint — adunk, összekeverjük és 25 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk. Ezután ismert módon (a darmstadti E. Merck cég által gyártott és 3383, cikkszám alatt forgalomba hozott „Merck—Test 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
