176133. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és szer az MB-kreotinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék- mintákban
7 176133 8 tát az antitestekkel összekeverjük és körülbelül 1—30 percig, előnyösen körülbelül 5 percig inkubáljuk +10 °C és 4-40 °C közötti, előnyösen a szobahőmérséklet körüli, különösen pedig 25—30 °C hőmérsékleten. Ezután a reakcióelégy visszamaradó enzim-aktivitását valamely ismert eljárással, célszerűen a fentebb leírt UV spektrofotometriás mérési módszerrel meghatározzuk. Egy ismert összetételű enzim-koenzim-szubsztrátum elegyhez, amely a módszer kiviteléhez szükséges valamennyi enzimet, koenzimet és szubsztrátumot tartalmazza, hozzáadjuk a szérum-antitest elegyet, majd elegendő mennyiségű puffer-oldatot, hogy a pH-érték körülbelül 7 legyen. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető szokásos készítmények, például heterokináz, glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz, adenozin-difoszfát és nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát elegyét tartalmazzák enzim-koenzim elegyként, szubsztrátumként pedig kreatin-foszfátot és glükózt. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy a szérum-antitest-elegyet a koenzim és enzim elegyéhez adjuk (vagy fordítva), majd ezt követően adjuk hozzá egy puffer és a szubsztrátum elegyét. E reakcióhoz semleges pufferek alkalmasak, például előnyösen trietanol-aminvagy imidazol-acetát-pufferek, továbbá egyebek között morfolin-propánszulfonsav- és morfolin-etánszulfonsav-pufferek. Az anyagok összekeverése .után az elegyet 1—10 percig, előnyösen 5 percig inkubáljuk 10—40 °C, előnyösen 25 vagy 30 °C hőmérsékleten, majd például szobahőmérsékleten meghatározzuk az extinkció változását. Ebből azután kiszámítható az MB-kreatinkináz-izoenzim B alegységének az aktivitása. Ennek az eljárásnak egyik előnyös kiviteli alakja esetében a fent leírt munkamenetet oly módon változtathatjuk meg, hogy a vizsgálandó testfolyadék mintáját az antitestekkel és a kreatinkináz-szubsztrátumokkal valamely puffer és a kimutatási reakciókhoz szükséges anyagok jelenlétében együtt inkubáljuk (a vizsgálandó minta és az antitestek elegyének előzetes külön inkubálása nélkül). Az eljárás e kiviteli módjához az antitestek egy további tulajdonsága szükséges: képeseknek kell lenniük az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének enzim-aktivitását kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen gátolni. Ezzel a tulajdonsággal például az olyan antitestek rendelkeznek, amelyeket kecskékből, teljesen aktíváit MM-kreatinkináz-izoenziin segítségével nyertek. Az ilyen antitestek lehetővé teszik a találmány szerinti eljárás egyszerűbb és gyorsabb kivitelezését a következő módon: Az előzőleg valamely ismert, a kimutatási reakcióhoz alkalmas koenzim-enzim-szubsztrátum eleggyel együtt liofilizált alakba vitt antitesteket például valamely pufferoldat meghatározott mennyiségében oldjuk, hozzáadjuk a meghatározandó testfolyadékot, például szérumot, majd meghatározzuk az MB-kreatinkináz-izoenzim B alegységének aktivitását. Ennek az eljárásnak az egyik változata oly módon is kivitelezhető, hogy az antitesteket csupán a koenzimek és enzimek elegyével visszük liofilizált alakba, a szubsztrátumokat pedig a pufferoldathoz adjuk. Az eljárás egy további előnyös kiviteli alakja esetében a kreatinkináz-összaktivitást és az MB-kreatinkináz-aktivitást egyidejűleg határozzuk meg a fent leirt előnyös módszerrel, egyetlen műveletben. így például oly módon dolgozhatunk, hogy előbb a minta kreatinkináz-összaktivitását határozzuk meg valamely «mert fotometriás eljárással, azután ugyanehhez az elegyhez egy, az MM-kreatinkináz-antitestekből álló, vízben oldott liofilizátumot adunk. Ezután körülbelül 1—10 percig, előnyösen 5 percig inkubálunk, majd fotometriás eljárással meghatározzuk a visszamaradó aktivitást. Ennél a kiviteli módnál is fennáll az az előfeltétel, hogy az antitesteknek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen gátolniuk kell az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alegységének enzim-aktivitását. Az antiszérumok antitest-kapacitását a találmány szerinti eljárás ilyen előnyös kiviteli alakjai esetében úgy állíthatjuk be, hogy azok 2500 egység/liter, előnyösen körülbelül 1000 egység/liter szintig teljesen gátolhassák az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének az aktivitását. Ha a megvizsgálandó minta kreatinkináz-összaktivitása túlságosan nagy ahhoz, hogy az antitestek ilyen gátlási kapacitása elérhető legyen, akkor ezeknek az eljárás-változatoknak az esetében is előzetes hígítást kell végezni, például olyan mértékben, hogy az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének az aktivitása körülbelül 1000 egység/liter legyen. A találmány szerinti eljárás igen lényeges előnyöket mutat az eddig ismert eljárásokkal szemben. Ezek között elsősorban az eredmények nagy pontossága, továbbá a kivitelezés gyorsasága és egyszerűsége említendő. A találmány szerinti eljárás pontossága arra vezethető vissza, hogy az alkalmazásra kerülő antitestek specifikusan az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének aktivitását gátolják, ezért lehetővé teszik az MB-kreatinkináz-aktivitás testfolyadékban, például humán-szérumban történő közvetlen meghatározását. Ezzel szemben a 21 28 670 és 22 58 822 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közrebocsátási iratokban ismertetett immunológiai eljárás az izoenzimek mennyiségi meghatározására különféle hátrányokat mutat. Az itt leírt eljárás szerint a kreatinkináz izoenzimjeit izoenzim-specifiküs precipitáló antitestekkel csapják le, majd az immun-lecsapás szupernatáns folyadékában megmaradó enzim-aktivitást határozzák meg. Eltekintve attól, hogy ez az eljárás körülményes, több specifikus antiszérum előállítását teszi általában szükségessé, minden esetben legalább két különböző meghatározást kell lefolytatni, nevezetesen a kreatinkináz* -összaktivitás meghatározását és a lecsapás után megmaradó kreatinkináz-aktivitás meghatározását. Az MB-kreatinkináz-aktivitást tehát csak különbség-mérés alapján lehet kiszámítani. Az eredményt ezért a hibaszámítás általános szabályainak megfelelően mindkét mérés bizonytalansága terheli. A találmány szerinti eljárás esetében viszont nem következik be a hiba-összegeződés, minthogy egy közvetlen mérést kell csak végezni. Az ismert lecsapásos eljárás további hátránya, hogy az immun-lecsapás szekunder reakcióként viszonylag sok időt (körülbelül 60 perctől több óráig) igényel és így ez az eljárás gyors vizsgálatokra egyáltalán nem alkalmas. A Clin. Chim. Acta, 58. köt., 223—232 old. (1957) ismertet már a kreatinkináz-izoenzimekkel szemben gátló képességű antitesteket. Ezek az antitestek az MM-kreatinkináz-izoenzim 100%-os gátlása mellett 80%osan gátolják az MB-kreatinkináz-iásenzimet is. így tehát az MB-kreatinkináz-izoenzim M-alegységének gátlása mellett lényeges résiben gátolják ezek az antitestek á B= alegység aktivitását is. (Az MB-kreatihkináz-izoeazim M- és B-alegységeinek aktiviták mindkét 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
