176103. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nembramicin-komplex előállítására mikrobiológiai úton
9 176103 10 L-glutamin 0,3% pálmaolaj és lenolaj 1: 1 arányú elegye 3,0% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 4,0% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk be, a sterilezést 121 C° hőmérsékleten 20 percen át autoklávban végezzük. A tenyésztést 4 cm kitéréssel, percenként 260-at forduló síkrázógépen végezzük 120 órán át, 37 C° hőmérsékleten. 100 ml tenyészlé pH-ját oxálsavval 2,5-re állítjuk be. A Ca++-mentes szűrletet ammónium-ciklusú, 200 mesh szemcseméretű Amberlite CG—50 gyantából (Fluka AG., Svájc) készült 1 cm átmérőjű és 12 cm magasságú kromatografáló oszlopra öntjük, majd ion-mentes vízzel mossuk. Az antibiotikumokat lineáris grádiens-elúcióval eluáljuk, törzsoldatként 120 ml 0,05 N és 120 ml 0,35 N ammóniumhidroxidot használunk. Az eluálás sebessége 6—8 ml/óra. 1,5 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A bioautográfiás vizsgálat szerint azonos antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson, 60 C° hőmérsékleten szárazra pároljuk. A termékeket súlyállandóságig szárítjuk, majd megmérjük súlyukat. A mérések szerint 100 ml tenyészlében 520 mg nebramicin-2 és 142 mg nebramicin-5' van, 18 mg nebramicin-4 mellett. Nem rezisztens törzzsel végezve a tenyésztést olyan fermentleveket kapunk, amelyek 100 ml-éből 142 mg nebramicin-2-t, 37,6 mg nebramicin-5'-t és 57 mg nebramicin-4-et izolálhatunk. 2. példa Nebramicin-2-t, nebramicin-5'-t és nebramicin-4-et tartalmazó tenyészlevek előállítása laboratóriumi fermentorbam Az la példában megadottak szerint izolált és rázott tenyészetekben az ld példa szerinti módon kivitelezett fermentáció eredményei (biológiai értékmérés, bioautográfia és oszlopkromatográfiás izolálás) alapján kiválasztott MNG 169 jelű Streptomyces tenebrarius törzzsel az alábbi összetételű, 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett, 100 ml térfogatú, csapvízzel készült táptalajt oltjuk: szójaliszt 2,0% kazein-hidrolizátum (10%-os) 3,0% ammónium-nitrát 0,1% ammónium-klorid 0,3% kalcium-karbonát 0,3% magnézium-szulfát pálmaolaj és lenolaj 1: 1 arányú 0,5% elegye glükóz (külön, 50%-os oldatként 3,0% sterilezve) 2,0% A táptalaj pH-ját nátriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk be, a sterilezést autoklávban, 121 C° hőmérsékleten, 20 percen át végezzük. A tenyésztést 16 órán át síkrázógépen folytatjuk, a 16. órában megvizsgáljuk az inokulumot. A mikroszkópi képben erőteljes növekedés látszik, fragmentált micéliumok észlelhetők. A tenyészet pH-ja 6,8—7,0. Az így kapott oltóképes inokulummal 10 liter hasznos térfogatú laboratóriumi üvegfermentorban 121 C° hőmérsékleten, 45 percen át sterilezett, 5 liter térfogatú, az alábbiakban megadott összetételű, csapvízzel készült táptalajt oltunk: szójaliszt 3,0% kazein-hidrolizátum (10%-os) 5,0% ammónium-nitrát 0,1% ammónium-klorid 0,5% L-glutaminsav 0,3% kalcium-karbonát 0,5% magnézium-szulfát 0,5% kobalt(II)-nitrát 0,001% pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegye 3,0% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 4,4% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátriumhidroxiddal 7,2-re állítjuk be. A fermentáció közben mérjük a biológiai aktivitást, bioautográfiával vizsgáljuk a termelt antibiotikumkomplex faktorösszetételét és a szénforrás fogyását. A fermentáció 96. órájában a tenyészlében nincs glükóz. A 120. órában erőteljesen fragmentált tenyészet látszik a mikroszkópi képben, később gyenge szekunder növekedés észlelhető. A tenyészet biológiai aktivitása a 120. órában éri el a maximumot; vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat szerint ekkor 100 milliliterenként 420 mg nebramicin-2-t és 90 mg nebramicin-5'-t tartalmaz, nebramicin-4 mellett. A fermentlé pH-ját 50%-os vizes kénsavval 2-re állítjuk be. Ezután a mikroorganizmus sejtjeit leszűrjük, és a szűrőn 1,5 liter vízzel átmossuk. A szűrletet és a mosóiét egyesítjük, és a kapott oldat pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 7-re állítjuk. Ezután a semlegesített oldat pH-ját keverés közben oxálsavval 2,5-re állítjuk be. A megsavanyított oldatot 20 percig keverjük, majd pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 7,5-re állítjuk, és a csapadékos oldatot leszűrjük. Az így kapott 5,1 liter szűrletet 3,6 cm átmérőjű, 60 cm magas, ammónium-ciklusú Wofatit CP—300-as ioncserélő oszlopon (VEB Farbenfabrik, Német Demokratikus Köztársaság) folyatjuk át. Az ioncserélő oszlopot először ionmentes vízzel kimossuk, majd 4 liter 0,15 n ammóniumhidroxiddal, ezután 2 liter 1 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk 200 ml-es frakciókat gyűjtve. A frakciók antibiotikum-tartalmát rétegkromatográfiás módszerrel analizáljuk az la példában leírt adszorbens réteget és kifejlesztő elegyet, valamint ninhidrines előhívást alkalmazva. A 4—19. frakciókat 80 C°-on, csökkentett nyomáson 300 ml térfogatúra bepároljuk. A kapott sűrítményt 1 g aktívszénnel kezelve derítjük, majd szűrés után csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. így 23,5 g nebramicin-2 bázis nyersterméket kapunk, melyet etanol és víz 7:1 arányú elegyéből átkristályosítva 17,1 g tiszta nebramicin-2 bázishoz jutunk. A 20—27. frakciókat 80 C°-on csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. így 6 g antibiotikum-keveréket kapunk, melynek főkomponense nebramicin-5' de a rétegkromatográfiás analízis szerint jelentős mennyiségben tartalmaz nebramicin-4-et és nebramicin-2-t is. Ezt a bepárlási maradékot 60 ml vízben oldjuk, majd 40 ml 1 n nátriumhidroxiddal 90 C°-on 2 órán át hidrolizáljuk. Szobahőmérsékletre való lehűlés után a reakcióelegy pH-ját 7,5 értékre állítjuk be 50% vizes kénsavval, majd 800 mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
