176103. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nembramicin-komplex előállítására mikrobiológiai úton
11 176103 12 aktívszénnel derítjük, és ezt követően szűrjük. A kiszűrt aktívszenet 2x15 ml vízzel mossuk. A mosófolyadékkal egyesített szűrletet 2,8 cm átmérőjű 40 cm magas Amberlite CG—50—I ioncserélő oszlopra (Fluka AG., Svájc) rétegezzük. Az oldat beszívódása 5 után az oszlopot ionmentes vízzel kimossuk, majd 800 ml 0,125 n, 800 ml 0,15 n, 800 ml 0,175 n, 800 ml 0,2 n és 800 ml 0,3 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk 100 ml-es frakciókat gyűjtve. Ezután a nebramicin-2-t, a nebramicin-5-öt (kanamicin B) és a nebramicin-6-ot a 10 rétegkromatográfiás analízis szerint egységesen tartalmazó frakciókat 80 C'-on, csökkentett nyomáson bepároljuk. A 4—12. frakciókból 0,8 g nebramicin-2 bázist, a 21—27. frakciókból 1,15 g nebramicin-5 (kanamicin-B) bázist és a 30—38. frakciókból 3,25 g nebramicin-6 bázist kapunk. Az így előállított nebramicin-6 bázist metanolból átkristályosítva 2,7 g analitikai tisztaságú nebramicin-6 bázishoz jutunk. 3. példa Nebramicin-2 előállítása laboratóriumi üvegfermentorban A 2. példában megadott fermentációs eljárást ismételjük meg az MNG 170 sorszámú törzzsel. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat szerint az előállított fermentlé 100 milliliterenként 560 mg nebramicin-2-t tartalmaz, kevés nebramicin-5' mellett. A fermentáció befejezése után a fermentlé pH-ját oxálsavval 2 értékre állítjuk be, a megsavanyított fermentlét 20 percig keverjük. Ezután a mikroorganizmus sejtjeit és a kivált kalciumoxalátot szüljük, majd a szűrőn 1,5 liter vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóiét 35 egyesítjük. Az egyesített oldat pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 7,5-re állítjuk be, majd szűrjük. A kapott 4,9 liter szűrletet 4 cm átmérőjű, 40 cm Bagas ammónium-formájú Wofatit CP—300-as ioncserélő oszlopon folyatjuk át. Ezután az ioncserélő oszlopot ion- 40 mentes vízzel kimossuk, majd 5 liter 0,12 n ammóniumhidroxiddal és ezt követően 1 liter 1 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk, 200 ml-es frakciókat gyűjtve. A frakciók antibiotikum-tartalmát rétegkromatográfiás módszerrel analizáljuk az la példában leírt adszorbens réteget és kifejlesztő elegyet, valamint ninhidrines előhívást alkalmazva. Az egységesen nebramicin-2-t tartalmazó 5—23. frakciókat bepárolva 27,3 g nebramicin-2 bázis nyersterméket kapunk, melyet etanol és víz 7:1 arányú elegyből átkristályosítva 22,1 g tiszta nebramicin-2 bázishoz jutunk. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás nebramicin-2, nebramicin-5' és nebramicin-4 előállítására mikrobiológiai úton Streptomyces tenebra-15 rius törzs felhasználásával, azzal jellemezve, hogy nebramicin-komplexet bioszintetizáló Streptomyces tenebrarius törzset nebramicin-2-t (apramicint) vagy nebramicin-5'-t (6"-0-karbamoil-tobramicint) vagy nebramicin-6-ot (tobramicint) tartalmazó táptalajon te- 20 nyésztünk, a 10 mg/ml és 30 mg/ml közötti, előnyösen 20 mg/ml mennyiségű nebramicin-2 és/vagy nebramicin-5' és/vagy nebramicin-6 jelenlétében növekvő, légmicéliumot fejlesztő és spórázó egyedeket elkülönítjük, az így kapott új, rezisztens törzseket, előnyösen az 25 MNG 169 és MNG 170 sorszámmal letétbe helyezett mikroorganizmusokat, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között nitrogén- és szén forrást, szervetlen sókat és adott esetben növényi és/vagy állati eredetű zsírokat és/vagy olajokat tartalmazó táptalajon, 30 előnyösen 35 C° és 38 C° közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a tenyészetben felhalmozódó nebramicin komplexet vagy adott esetben a nebramicin-2-t, nebramicin-4-et (6"-0-karbamoil-kanamicin-B) és nebramicin-5'-t ismert módon elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt nitrogén forrásként szójalisztet, kazeint, aminosavakat, aminosav-származékokat és szervetlen sókat, szénforrásként glükózt és növényi és/vagy állati eredetű zsírokat és/vagy olajokat tartalmazó táptalajon végezzük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy növényi olajként lenolaj és pálmaolaj elegyét használjuk. ________A kiadásért felel: a Közgazdasági fa Jogi Könyvkiadó igazgatója 81.947.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató 6
