176003. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergokrisztint termelő, rozsra-virulens claviceps-purpurea törzs spóratenyészetének előállítására
3 176003 4 2. a törzs fermentációs elszaporításával rozsfertőzésre alkalmas spórák előállítása és ezek konzerválása a felhasználásig. A találmány célkitűzésére jobb hozammal, magasabb ergokrisztin tartalmú törzs előállítása, mely — mesterséges táptalajokon agar felületen és süllyesztett levegőztetett tenyészetben jól spórázik, — a spórák megfelelően rezisztensek, tehát jól tartósíthatok, — a spórák életképesek és virulensek, tehát újra táptalajközegbe juttatva 98—100?^ban kicsíráznak és rozsra juttatva azt fertőzik, — a területegységenként kifejlődő drog mennyisége magas, — a drog főalkaloidtartalma magas, és a főalkaloidokon kívül csak jelentéktelen mennyiségű mellékalkaloidokat tartalmaz. Az új törzs előállítását az ivaros és a szelekciós nemesítés kombinált alkalmazásával az alábbi módon végeztük: A kiindulási törzsből, mely a Gyógynövény Kutató Intézet saját törzs-gyűjteményében 661/1974. számot viseli, a morfológiai szempontok figyelembevételével küllemileg megfelelő, fejlett, sima felületű szkleróciumokat választottunk ki. Ezeket nedves homokba helyezve 6 hétig 0—5 °C-on tartottuk, majd leöblítve nedvesen tartott steril szivacsra raktuk. A sztrómák megjelenése 12 nap elteltével megkezdődött, és a megjelent sztróma kifejlődése 6 nap alatt végbement. Spóiáztatásra azon szkleróciumok sztrómáit választottuk ki, amelyek csak néhány (3—4) gombafejet hajtottak, majd a 4 mm-t meghaladó keresztmetszet átmérőjű sztrómák közül azokat, amelyek felületén a peritéciumok kitüremkedései mikroszkópi vizsgálat alapján a legnagyobbak voltak. Ezeket folyékony maláta táptalaj fölött, steril körülmények között, hőráhatással spóráztatásra készítettük. A mikroszkópi vizsgálattal ellenőrzött, aszkospórákat tartalmazó folyadékból szilárd maláta-agar táptalajra szélesztést végeztünk. Az 1-1 aszkospórából fejlődő telepek közül a telep fejlődési üteme és spóratermelő képessége szerint választottunk. A kiválasztott telepek spóráit felszaporítva izolált, parazita körülmények közé helyeztük antézis előtti állapotban levő rozs növények kalászainak oltótűs fertőzésével. A rozsról azokat a szkleróciumokat választottuk ki, melyek kifejlődésénél a legrövidebb volt a mézharmat és a szklerócium kezdemény megjelenése között eltelt idő. Az így gyűjtött szemeket vékonyrétegkromatográfiás módszenei analizáltuk. A további szelekció az ergokrisztintartalom és a mellékalkaloid szennyezés alapján történt. Az ivaros szaporításból nyert szkleróciumok tenyészetei még egy szelekciósoron estek át, amikor szkleróciumforgácsból szilárd táptalajon növesztett teleppel oltva süllyesztett tenyészetet készítettünk és a legjobban spórázó, legmagasabb életképességű és legmagasabb virulenciájú tenyészeteket szabadföldi kísérletekben szelektáltuk droghozam és a drog átlagos alkaloidtartalma alapján. A fentiekben ismertetett törzs azért előnyösebb az eddig ismerteknél, mert a szelekciók sorozatát végeztük el két, - a parazita fejlődést is magába foglaló - szaporítási ciklus egymást követő lépéseiben. Az új törzs, melyet az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00163 szám alatt letétbe helyeztünk, előnyös tulajdonságokkal rendelkezik az oltóspórakészítmény üzemi előállításában, mert növeli a fermentáció spórahozamát és kedvező a szabadföldi drogtermesztésben, mert növeli a droghozam mennyiségét és jelentősen javítja a drog minőségét. Az új törzs a kiindulási tenyészethez képest a fermentációs és termesztési eljárásokban az alábbi eredményt adja: OKI 00163 GYNKI % 661/1974 felületi spóratermelő képesség spóra/cső 1-2x10’ 0,5-1x10’ fermentlé spóraszáma spóra/ml 4-5x10* 1-2x10* oltóspóra készítmény csíraképessége % 95-99 90-96 Virulencia (fogamzás a szúrások %-ában Fitotronban) 70-80 50-60 ezer szem súlya g 175-200 140-170 droghozam kg/ha (kísérleti üzemben) 200-350 150-220 ergokrisztin tartalom mg/g 5,0-6,2 2,6-3,6 Mellékai kai oi dók : ergometrin 0,2-0,3 0,1 -0,2 ergotamin nyom 0,05-0,1 zsírosolaj tartalom % 15-20 16-18 Ergokrisztin hozam g/ha (átlag kg/ha x átlag mg/g 1540 ^ (Gyógynövény Kutató Intézet) 590 A szelektált és a kiindulási törzs morfológiai jellemzői. OKI 00163 törzs a) maláta agáron 28 nap után 0,5-0,6 cm-es fehér színű, rövid légmicéliumos telepek, 12. naptól kezdve konídiumképzés, a konídiumok méretelosztása 1,3/ot- 3,8tan, leggyakoribb méret 2,5pm. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
