175601. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás szekunder glikozidok előállítására primer digitálisz glikozodokból
6 175601 5 Fenti tulajdonságok alapján a törzs a Streptomyces griseolus (Waksman) Waksman et Henrid 1948 fajhoz tartozik. [Waksman: The Actinomycètes Vol. 2. (The Williams Wilkins Company, Baltimore) 1961, 222—223 oldal], A találmány szerinti eljárásban használt mikroorganizmusok tenyésztésére a sugárgombák tenyésztésénél általánosan szokásos módszerek alkalmazhatók. A tenyésztést legelőnyösebben süllyesztett kultúrában végezhetjük. A tenyésztésre szolgáló táptalajban vízben oldott, illetve szuszpendált, a gomba által asszimilálni képes szén- és nitrogénforrások, szervetlen sók és egyéb járulékos alkatrészek (biosz-anyagok, habzásgátlók) lehetnek jelen. Szénforrásként maláta, glükóz, maltóz, szacharóz vagy egyéb cukrok, zsírok, zsírsavak, aminosavak és peptidek alkalmasak. Asszimilálható nitrogénforrásként mikrobiális, állati vagy növényi eredetű és/vagy anorganikus nitrogénvegyületek, úgymint élesztőkivonat, pepton, húskivonat, hidrolizált kazein, szójaliszt, kukoricalekvár, ammóniumsók és nitrátok jöhetnek számításba. Gazdasági szempontokat is szem előtt tartva szénforrásként legelőnyösebb glükózt, míg nitrogénforrásként szójalisztet és kukoricalekvárt tartalmazó táptalajt használni. A táptalaj alkotórészeit csapvízben oldva, illetve szuszpendálva együttesen sterilezzük 121 °C-on 20— 45 percig, kivéve a redukáló cukrokat, amelyeket célszerű külön sterilezni. A találmány szerinti törzsek tenyésztését 22— 37 °C-on, célszerűen 28 °C-on végezzük. Az organizmus a levegőzésre és a keverő fordulatszámára nem nagyon érzékeny, 100 literes fermentorban 100 liter/perc levegővel, 400 fordulat/perc fordulatszámmal gyors átalakításra alkalmas tenyészet nyerhető, de hasonló eredményeket kapunk ettől nem jelentősen eltérő levegőtérfogat és fordulatszám mellett is. A találmányban alkalmazott szubsztrátumokat vízzel elegyedő, biológiai rendszerek működését nem vagy kevéssé károsító szerves oldószerekben (etanol, metanol, dimetilformamid, dimetilszulfoxid, aceton, tetrahidrofurán), célszerűen metanolban oldjuk, sterilre szűrjük és a kinőtt, maximális enzimaktivitással rendelkező tenyészethez adjuk. Az átalakítást levegőztetett, keverővei ellátott edényben végezzük. 22—37 °C-on, célszerűen 28—32 °C-on. Az átalakítás folyamatát el lehet különíteni a fermentálás folyamatától, amennyiben az átalakításra kész tenyészetből enzimpreparátumot készítünk. Az enzimpreparátum az „acetonos száraz por” készítésének közismert módszerével készíthető. A béta-glükozidáz és acetiláz enzimaktivitás mintegy 70%-a az „acetonos száraz por”-ban megtalálható. Az enzimpreparátum aktivitása — 4—6 °C-os hűtőben tárolva — egy hónapig nem csökken. Az átalakítás után a szekunder glükozidokat tartalmazó fermentléből a szekunder glükozidokat vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel (kloroform, diklóretán, etilacetát, metilizobutilketon stb.), célszerűen kloroformmal nyerjük ki. A micéliumra kötődött szekunder glükozidok leoldását vízzel elegyedő szerves oldószerrel (etanol, metanol, aceton stb.), célszerűen metanollal segíthetjük elő. Az átalakítás lefolyása vékonyrétegkromatográfiával követhető. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa A Streptomyces griseolus (MNG 168) egyhetes burgonyaglükózos ferde agaros tenyészetére steril fiziológiás sóoldatot öntünk, és az agar-agar felületét steril kaccsal felkaparjuk. A csőről lekapart szuszpenzióval oltjuk be a következő öszszetételű táptalajt (inokulum) (3-literes lombikban 1 liter hasznos térfogat) : 2% glükóz, 1% szójaliszt, 0,5% kukoricalekvár (nedves súly, 50% szárazanyagtartalomra számolva), 0,2% pepton, 0,3% kalciumkarbonát. A tenyészetet rázógépen 28 °C-on, 36—48 órán át rázatjuk. 3 db inokulum-lombik tartalmával oltunk be 1 db 100 liter hasznos térfogatú, félüzemi, keverős fermentort. A fermentálás paraméterei: fordulatszám 400 liter/perc, levegő: 100 liter/perc. Habgátlóként étolajat használunk. A tenyésztés hőfoka 28 °C. Sö-^S órai fermentálás után a tenyészet a kívánt enzim-aktivitással rendelkezik. 500 g lanatozid A-t 10 liter forró metanolban oldunk, az oldatot Seitz-szűrőn megszűrjük, majd steril körülmények között, keverés közben az átalakításra alkalmas tenyészethez adagoljuk. Az átalakítás menetét vékonyrétegkromatográfiával követjük (Kieselgel G lemezen, futtató elegy: etilacetát-ciklohexán-abszolut etanol = 55:35:10 arányú keveréke). A szubsztrátum 48— 60 óra múlva eltűnik, és a lemezen kizárólag a képződött szekunder-sorbeli vegyület, a digitoxin látható. Az átalakítás befejeztével a fermentlevet megszűrjük. A micéliumot 80 liter metanollal 2 órán át kevertetjük, majd szűrés után újabb 80 liter metanollal megismételjük a fenti műveletet. A metanolos-vizes áztatóleveket egyesítjük, 40 °C alatt vákuumban 5 literre bepároljuk, majd 24 órán át 0 °C-on kristályosítjuk. A kristályokat 70%-os vizes metanollal mossuk (I. nyerstermék). A kristályosítás anyalúgját és mosófolyadékát 3X1/2 térfogat kloroformmal extraháljuk, majd szárazra pároljuk (II. nyerstermék). A szűrletet 3X1/2 térfogat kloroformmal extraháljuk, majd szárazra pároljuk (III. nyerstermék). Az egyesített II—III. nyersterméket 5 liter 50%-os metanolban felvesszük és 2 liter petroléterrel extráháljuk. A vizes metanolos fázist szárazra pároljuk (I—III. félkésztermék). A petroléteres fázist elöntjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
