175584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amiláz mentes ciklodextrin-glükozil-transzferáz enzim tisztítására
5 175584 6 10%-os térfogatban vesszük, előnyösen 5 térfogatszázalékban oltjuk át. Az oltóanyag előállítása és a fermentáció végrehajtása 28—37 °C-on, előnyösen 37 °C-on történik. A levegőztetés 0,5—1,5 liter levegő/liter fermentlé/perc, előnyösen 1 liter levegő/liter fermentlé/perc. A fermentációs táptalajt, mely előnyösen zablisztet és/vagy kukoricalisztet tartalmaz szénforrásként összesen 5% koncentrációban, a sterilezés előtt Chinoin gyártmányú Bacillus subtilis eredetű a-amilázzal elfolyósítjuk. Az a-amiláz koncentráció 0,001—0,003%, előnyösen 0,002% táptalaj-térfogatra vonatkoztatva 5000 SKB E/g aktivitású enzimből (Ernährungsforschung, 7, 575, 1962.). A hidrolízist 60—80 °C-on, előnyösen 70 °C-on, 20—60 percig, előnyösen 30 percig végezzük. A fermentáció befejezése után a fermen tlevet szűrjük, a szűrletet 30—40 °C-on, előnyösen 40 °C-on vákuumbepárlással térfogatának 1/10-ére koncentráljuk. A koncentrátum stabilan eltartható ciklodextrin-glükoziltranszferáz aktivitás veszteség nélkül, +4 °C-on 1 évig. Ez a ciklodextrin-glükoziltranszferáz koncentrátum közvetlenül felhasználható ß-ciklodextrin konvertálására. A találmány szerinti eljárással gazdaságosan valósítható meg a ciklodextrin-glükozil-transzferáz enzim ipari előállítása. A bejelentésben szereplő aktivitási egységek az alábbi irodalmi helyeken szeretjeinek : SKB egység: alfa-amiláz aktivitási egység [Sandstedt, Kneen, Bergstroem, Cereal. Chem. 29, 108 (1952.)] Tilden-Hudson egység: Ciklodextrin-glükozil-transzferáz aktivitási egység [Tilden, Hudson; J. Bacteriology 43, 527 (1942.)] Fuwa-egység : Ciklodextrin-glükozil-transzferáz aktivitási egység [Fuwa; J. Biochem. 41, 583 (1954.)] A következő példákban bemutatjuk eljárásunk részleteit. 1. példa Rothadt burgonyadarabokat steril (4 g ß-ciklodextrin, 20 egység/ml nystatin, 1000 ml csapvíz összetételű, pH= =6,8—7,0) táptalajba teszünk és 28 °C-on, 72 órán át rázóasztalon tenyésztjük. A 72 órás inkubáció után a következő összetételű „A” szilárd tápanyagra szélesztjük a kapott tenyészetet: 23 g Bacto nutrient agar 0001, 1000 ml víz, pH=6,8—7,0. A tenyészetet 37 °C-on 6—7 napig inkubáljuk. Ezután az „A” táptalajon kifejlődött egyedeket izoláljuk, majd „Aj” spóráztató táptalajra szélesztjük és inkubáljuk 37 °C-on, 7 napig. Az „A,” spóráztató táptalaj összetétele: 150 g burgonyaszelet, 15 g kalcium-karbonát, 25 g agar-agar, 800 ml viz, pH=6,8—7,0. Az „Aj” táptalajon kapott tenyészeteket ciklodextrin-glikoziltranszferáz aktivitásra vizsgáljuk a 3. példában megadott, rázóasztalon történő tenyésztési körülmények között. A megvizsgált 135 db Bacillus species törzsből 88 db Bacillus törzs rendelkezett ciklodextrin-glükoziltranszferáz szintetizáló képességgel. Az adott körülmények között a fermentáció végén 5—10 THE/ml ciklodextrin-glükoziltranszferáz aktivitás volt kimutatható. 2. példa Az 1. példa szerint előállított, és fiziológiai szempontból a legelőnyösebbnek mutatkozó (többszöri átoltás 5 után is stabil ciklodextrin-glükoziltranszferáz szintetizáló képességű, gyors szaporodású) Bacillus törzsnek az 1. példában megadott „A,” spóráztató táptalajon kifejlődött tenyészetéből spóraszuszpenziót készítünk. A szuszpenzió élő csíra tartalma lO^ml. A spóraszusz- 10 penziót ultraibolya sugárral besugároztuk [20 W-os AMIKROB A/20 higanygőzlámpa, gyártja a Fémtömegcikk ipari Vállalat, Kalocsa; a besugárzás távolsága 54 cm, ideje 10 perc] majd a következő összetételű „A2” szelektív táptalajra szélesztjük. 15j| Az „A2” szelektív táptalaj összetétele: 23 g Bacto nutrient agar 0001, 4 g ß-ciklodextrin, 1000 ml desztillált víz, pH=6,8—7,0. A tenyészetet 37 °C-on 7 napig inkubáljuk, majd ugyancsak „A2” szelektív táptalajra izoláljuk az egyedeket. Az izolált egyik törzs a 20 BM—10—68 (OKI 00154), mely a 3. példában ismertetett fermentációs körülmények között a legnagyobb ciklodextrin-glükoziltranszferáz szintetizáló képességgel rendelkezik. 25 3. példa 500 ml-es Erlenmeyer lombikba 100 ml „B inokulum” jelű táptalajt mérünk be. A táptalaj összetétele: 30 g 30 zabliszt, 3 g diammónium-hidrogén-foszfát, 15 g kalcium-karbonát, 34 g A3-Antihabzin jelű készítmény és 1000 ml csapvíz: pH-ja 6,8—7,0 körüli. A táptalajt 0,5 m lO^ml élő csíra-tartalmú spóraszuszpenzióval oltjuk be, amely spóraszuszpenziót a Bacillus species 35 BM—10—68 (OKI 00154. sz.) törzs 1. példában megadott „A,” spóráztató táptalajon előállított tenyészetéből készítettünk. Az Erlenmeyer lombik tartalmát 28 °C-on 48 órán át inkubáljuk rázóasztalon [280 fordulat/perc; 2,5 cm lökethossz]. A kapott tenyészetet 40 oltóanyagnak használjuk. 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 100 ml „Bj” jelű fermentációs táptalajt mérünk be, és beoltjuk a fenti tenyészet 5 ml-ével. A „B,” jelű táptalaj összetétele: 50 g zabliszt, 4 g diammónium-hidrogén-foszfát, 20 g 45 kalcium-karbonát, 4 g A3-Antihabzin készítmény, 1000 ml csapvíz; pH-ja mintegy 6,8—7,0. A fermentálást 28 °C-on 13 napig folytatjuk rázóasztalon. A fermentáció befejezésekor a fermentlé ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzim-tartalma 150 THE/ml; Fuwa szerint 50 [J. Biochem., 41, 583 (1954)] mérve 240 Fuwa-egység/ml. 4. példa 55 A Bacillus species BM—10—68 (OKI 00154.) törzs 3. példa szerint előállított oltóanyagának 5 ml-ével a következő összetételű „B2” fermentációs táptalaj 100 miét oltjuk be (500 ml-es Erlenmeyer lombikban): 50 g zabliszt, 4 g diammónium-hidrogén-foszfát, 20 g kal- 60 cium-karbonát, 4 g A3-Antihabzin, 1000 ml csapvíz, pH=6,8—7,0. Az összeállított táptalajt 5 percig forraljuk, majd 70 °C-ra hűtjük, s a pH-t 6,8—7,0-re állítjuk be. Ezután 50 ml csapvízben felszuszpendált a-amiláz [5000 SKBE/g] adunk hozzá. A hidrolízist 70 °C-on 30 65 percig végezzük, majd a táptalajt 120 °C-on, 30 percig 3
