175584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amiláz mentes ciklodextrin-glükozil-transzferáz enzim tisztítására
3 175584 4 A találmány szerint úgy járunk el, hogy az enzimet termelő valamely Bacillus törzset ß-ciklodextrint tartalmazó szelektív táptalajon tenyésztjük, majd ismert módon, célszerűen ultraibolya vagy röntgen besugárzással mutáljuk és a mutánsokat ismét ß-ciklodextrint tártál- 5 mazó szelektív táptalajon tenyésztjük, az ilyen módon kapott 150—250 THE/ml enzimaktivitású törzseket, előnyösen az MNG 00154 jelű Bacillus törzset a-amilázzal elfolyósított keményítőt tartalmazó táptalajon fermentáljuk és a fermentáció befejezése után a ciklo- 10 dextrin-glükozil-transzferáz enzimet ismert módon izoláljuk. A kiindulási Bacillus speciesként rothadt burgonyáról izolált törzseket alkalmazunk. Előnyösen alkalmazható törzsek a Bacillus megathe- 15 rium, Bacillus maceráns vagy Bacillus polymyxa, Bacillus amylobacter vagy a Bacillus circulans, illetve a Bacillus termophylus. A szelektív táptalajban 0,1— 0,5%, előnyösen 0,4% ß-ciklodextrint teszünk. A rothadt burgonya darabokat a következő összetételű fo- 20 lyékony táptalajba helyezzük: 0,4% ß-ciklodextrin, 20 E/ml Nystatin (Chinoin gyártmány, Budapest); pH= =6,8—7,0. A tenyészetet 28 °C-on, rázóasztalon rázzuk (a Nystatint a gombák szaporodásának gátlására alkalmazzuk). A 72 órás inkubáció után a tenyészetet a kö- 25 vetkező összetételű szilárd táptalajra szélesztetjük : 23 g Bacto-nutrient agar 0001 (gyártó cég: Difco, Detroit, Amerikai Egyesült Államok), 0,4 g ß-ciklodextrin (laboratóriumi előkísérletekkel Chinoinban előállítva), 1000 ml desztillált vízben (pH=6,8—7,0). A tenyészetet 30 37 °C-on, 7 napig inkubáljuk. A kifejlődött telepek közül a leggyorsabban növő Bacillus specieseket kiválasztjuk, és többszöri átoltás után a legnagyobb (5—10 THE/ml) ciklodextrin-glükoziltranszferáz aktivitást mutató Bacillus specieseket ismert módon mutáljuk. Mutagénként 35 ultraibolya besugárzást vagy röntgen besugárzást alkalmazunk. A mutagén kezelések után egyszerűen a nagyobb telepek izolálása révén, szelektíven nyerjük a nagy (150— 250 THE/ml) ciklodextrin-glükoziltranszferáz aktivitású Bacillus törzseket. Az eredményeket a következő táblázat foglalja össze: 1. táblázat Szelektív táptalaj Kontroll táptalaj Telep-átmérő (mm) THE/ml sS ■ Telepátmérő (mm) THE/ml Telep ( %-ban) 0,1 44 0,1 38 0,2 5—10 34 0,2 5—10 62 0,3 10—100 19 — — — 0,5 100—200 3 — — — 2. táblázat A minta* vétel száma Ax táptalajon nyert szubkultúrák Mutagén kezelésre vitt szubkultúrák összes száma 5—10 THE/ml tartományba esők száma Jele Ciklodextrin-g íűkozü-t ranszferáz aktivitása (THE/ml) BM—1 21 9 BM—1—18 6 BM—2 19 14 BM—2—19 7 BM—3 27 17 BM—3—13 10 BM—4 26 22 BM—4—10 8 BM—5 11 22 BM—5—14 2 BM—6 21 26 BM—6—2 7 3. táblázat Mutagén kezelés jele Kezelésre vitt törzs jelzése Mutagén kezelés típusa As táptalajon nyert szubkultúrák száma Aa tápt.-on nyert szubkultúrák jelzése Max. aktív, szub jele kult. cgt-áz akt. THE/ml BM—7 BM—1—18 UV besúg. 21 BM—7—1—21 BM—7—7 18 BM—8 BM—2—19 Röntgen 5 BM—8—21—26 BM—8—25 2 BM—9 BM—3—13 UV besúg. 29 BM—9—26—55 BM—9—31 75 BM—10 BM—4—14 UV besúg. 24 BM—10—55—79 BM—10—68 180 BM—11 BM—5—10 UV besúg. 17 BM—11—79—96 BM—11—92 150 BM—12 BM—6—2 UV besúg. 25 BM—12—96—121 BM—12 90 A kontroll táptalaj összetétele: 23 g Bacto nutrient agar 0001, 1000 ml desztillált vízben. A szelektív táptalaj összetétele: 23 g Bacto nutrient agar 0001, 4 g ß-ciklodextrin, 1000 ml desztillált vízben. Az így kapott, nagy enzimaktivitású törzsek közül példaképpen egyet, a Bacillus BM—10—68 jelzésű törzset az Országos Közegészségügyi Intézetben, a Nemzeti Törzsgyűjteményben 00154 lajstromszám alatt letétbe helyeztük 1976. december 8-án. A Bacillus BM—10—68 törzzsel történő fermentációnál szénhidrátként 1—7%, előnyösen 5% koncentrációban zablisztet és/vagy kukoricalisztet, burgonyaszeletet, burgonyakeményítőt, illetve maltózt is alkalmazhatunk. Szerves nitrogénforrásként kukoricalisztet, zablisztet alkalmazunk, de alkalmazhatunk 0,5—4,0% koncentrációban élesztőkivonatot, kukoricalekvárt, kazein-hidro-50 lizátumot vagy peptont; szervetlen nitrogénforrásként 0,1—0,8% koncentrációban valamilyen ammónium-sót, előnyösen diammónium-hidrogén-foszfátot használunk ; a fermentációs táptalajokon a megfelelő pH biztosítására kalcium-karbonátot alkalmazunk 0,5—3,0%, előnyö- 55 sen 2,0% koncentrációban; habzásgátlásra A3-Antihabzint (160 474 lajstromszámú magyar szabadalmi bejelentés, összetétele: propilénglikol+poliakrilsav, illetve poliakrilsavamid, Chinoin gyártmány) alkalmazunk 0,1—0,6%, előnyösen 0,4% koncentrációban. 60 A táptalajok pH-ja 6,8—7,0. Az oltóanyag előállítására ugyanazon összetételű táptalaj alkalmas, azonban előnyösebb a táptalaj komponensek kisebb koncentrációját használni. A kifejlődött 65 oltóanyagot fermentációs táptalajra vonatkoztatva 1—* 2
