175575. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kanamicin-származékok előállítására
19 175575 20 namicin B (BB—K 140) 10 ml vízzel készült oldatához adjuk az így nyert aktívészter-oldatot, és éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük az elegyet. Szűrjük a reakcióelegyet, és csökkentett nyomáson ledesztilláljuk a szűrletről az oldószereket. 5 ml vízben feloldjuk a maradékot. és egy CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 45 ml) töltött oszlopra visszük fel az oldatot. Az oszlopot egymás után 200 ml vízzel, 1500 ml 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal, majd 500 ml 0,3 normál ammónium-hidroxid-oldattal mossuk. 10 ml-es eluátum-frakciókat szedünk. A kívánt köztitermék a 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluált 58—72. frakcióban található, míg a 0,3 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluált frakciókból 163 mg (35%) BB—K 140-et nyerünk vissza. A köztitermék 20 ml 50%-os vizes tetrahidro-furánnal készült oldatát 30 mg 10% csontszenes palládium jelenlétében éjszakán át atmoszferikus nyomáson hidrogénezzük. Szűrjük a reakcióelegyet, majd kb. 4 ml térfogatra betöményítjük a szűrletet. Amberlite CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 10 ml) töltött oszlopra visszük fel a koncentrátumot, majd az oszlopot 150 ml vízzel mossuk, és egymás után 350 ml 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal, 300 ml 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal, 150 ml 0,3 normál ammónium-hidroxid-oldattal, végül pedig 300 ml 0,5 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. 15 ml-es eluátum-frakciókat szedünk. A vékonyrétegen (szilikagél lemez, futtatóelegy: kloroform—metanol—28%-os ammónium-hidroxid—víz 1 : 4 : 2 : 1 arányú elegye) Rf= 0,22-nél bioaktív foltot adó 67—68. frakciót egyesítjük, és egy CG—50 ioncserélő gyantával (alsó rész: NH4+fázis, 1 ml; felső rész: réztetrammin-fázis, 2 ml) oszlopon újra kromatografáljuk. Az oszlopot 100 ml 0,5 normál ammónium-hidroxid-oldattal, majd 50 ml 1,0 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk, 5 ml-es eluátum-frakciókat szedünk. A 15—33. frakciót egyesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk az oldószert, így 29,4 mg (5%) kívánt bioaktív terméket, BB—K 142-t nyerünk. Olvadáspont: 188—192 °C (bomlik), IR- spektrum (Kft-): vco 1640 cm-1. Analízis f"23ll4^N^Oj2.2H2CO3 képletre: számított: C 41,55, H 6,97, N 11,63%, talált : C 41,52, H 6,72, N 10,95%. A BB—K 142 egy kis mintáját 0,5 normál nátrium-hidroxid-oldattal 1 órán át 100 °C-on melegítve 6'-N-metii-kanamicin B és L-Y-amino-a-hidroxi-vajsav keletkezik, amint ezt a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok igazolják. 8. példa 1 -N -fL-(—)- ß-Amino-a-hidroxi-propionil]-6'-N-metil-kanamicin B (BB—K 148) 120 mg (0,5 millimól) N-Cbz-L-izoszerin, 58 mg (0,5 millimól) N-hidroxi-szukcinimid és 103 mg (0,5 millimól) diciklohexil-karbodiimid 5 ml tetrahidro-furánnal készült elegyét éjszakán át 5 °C-on kevertetjük. Szűrjük az elegyet, és 248 mg (0,5 millimól) BB—K 140 5 ml vízzel készült oldatához adjuk a szűrletet, majd éjszakán át kevertetjük az elegyet. A tetrahidrofurán ledesztillálása után egy Amberlite CG—50 ioncserélő gyantával (NH4-+fázis, 10 ml) töltött oszlopra visszük fel a vizes oldatot. Az elúciót 300 ml 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal, majd 300 ml 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal végezzük, és 10 ml-es frakciókat szedünk. A kívánt köztiterméket a 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluált 18—31. frakcióból, az oldószer ledesztillálásával nyerjük ki, a 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluált frakciókból pedig 69 mg (28%) BB—K 140-et nyerünk vissza. 20 mg 10%-os csontszenes palládium jelenlétében éjszakán át hidrogénezzük a köztitermék 10 ml vízzel készült oldatát, a katalizátort kiszűrjük, és kb. 5 ml térfogatra betöményítjük a szűrletet. Amberlite CG—50 ioncserélő gyantával (NH4+-fázis, 8 ml) töltött oszlopon kromatografáljuk a koncentrátumot, az oszlopot egymás után 280 ml 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal, 340 ml 0,1 normál ammónium-hidroxid-oldattal, majd 200 ml 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. A 0,2 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluált frakciókból nyerjük ki a kívánt bioaktív komponenst (35 mg). Ezt a vékonyrétegen két-három ninhidrin-pozitív foltot mutató terméket CG—50 ioncserélő gyantával (alsó rész: NH4+-fázis, 1 ml; felső rész: réztetrammin-fázis, 2 ml) töltött oszlopon való újrakromatografálással tisztítjuk. Az oszlopot egymás után 60 ml 0,3 normál ammónium-hidroxid-oldattal, 110 ml 0,5 normál ammónium-hidroxid-oldattal, majd 100 ml 1,0 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. Az 1,0 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluált 40—50. frakcióból nyerjük ki a kívánt terméket, a BB—K 148-at. Termelés 8,1 mg (3%), olvadáspont: 190—198 °C (bomlik), IR-spektrum (KBr): vco 1630 cm'1. 9. példa l-N-[L-(—)-S-Amino-a-hidroxi-valeril]-6'-N-metil-kanamicin B A ő'-N-metil-kanamicin A-ra az 5. példában leírt eljárást a 6'-N-metil-kanamicin B ekvimoláris mennyiségére alkalmazva nyerjük a kívánt terméket. Az Amberlite CG—50 egy gyengén savas jellegű, karboxilos-polimetakrilsavas típusú kationcserélő gyanta kromatográfiai célokra készített változatának kereskedelmi neve. Az Amberlite CG—50 ioncserélő gyanta réztetrammin-fázisú formáját a következőképpen készítjük: a CG—50 ioncserélő gyanta (NH4+-fázis) vizes szuszpenziójához kevertetés közben 10%-os réz(II)-szulfát-oldatot adunk, ekkor a CG—50 ioncserélő gyanta réz(II)-sója keletkezik. Ezt kiszűrjük, vízzel többször kimossuk, majd kevertetés közben 1 normál ammónium-hidroxid-oldattal kezeljük. Utána szűrjük, vízzel többször kimossuk, így megkapjuk a CG—50 ioncserélő gyanta sötétkék színű, réztetrammin-fázisű formáját. 10. példa l-(L-(—)-Y-Amino-a-hidroxi-butiril]-6'-N-metilkanamicin A vagy B monoszulfát 1 mól l-pL-(—)-Y-amino-a-hidroxi-butiril]-6'-N-me-til-kanamicin A-t vagy B-t 1—3 liter vízben oldunk. Az oldatlan szilárd részeket kiszűrjük az oldatból. 1 mól kénsav 500 ml vízzel késiült oldatát adjuk a behűtött 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
