175512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hipfizis szövetekből származó protein hormonok izolására és kinyerésére
5 175512 6 A kicsapott frakciókat ismert módon dolgozzuk fel. A csapadékot pl. centrifugálhatjuk, majd pufferben újra feloldjuk, pl. pH = 6,5—8, előnyösen pH = 7 értékű pufferben. Ezután telített ammónium-szulfát oldattal történő kicsapás következik. A kapott csapadékot centrifugáljuk és újra feloldjuk pufferben, amelyet molekulaszitát vagy savas vagy bázikus ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon kromatografálunk. A kromatográfia révén a tiszta hipofízis hormonokat tartalmazó frakciókat, pl. a növekedési hormont kapjuk izoláltan. A találmány szerinti eljárással kapott emberi növekedési hormont amino-ecetsav hozzáadásával stabilizáljuk és a pH-t nátrium-hidrogénkarbonát hozzáadásával állítjuk be, az anyagot liofilizáljuk. A kapott készítmény (Nanormon) fehér por formájú. Az egységdózis (1,92 mg protein) aktivitása 4 nemzetközi egység, relatív zavarossága 26, növekedési hormon monomer tartalma 96%, polimer tartalma 2%. Az egységdózis 1,92 mg 4,6 egység immunológiai aktivitású és 4,1 biológiai aktivitású és 2,1 egység/mg fajlagos biológiai aktivitású anyagból áll. A Nanormon az egyéb eljárásokkal kapott hasonló termékekhez képest nagyfokú tisztaságával tűnik ki. A találmány szerinti eljárás részleteit a következő példákkal szemléltetjük: 1. példa 24 mélyhűtött agyfüggelék-mirigyet homogenizálunk és hozzáadunk 100 ml (I) puffert, amelynek összetétele a következő: 1,8% dinátrium-hidrogénfoszfát vizes oldata 1 n nátriumhidroxiddal összekeverve, pH = 8,7. Az elegyet centrifugáljuk. 90 ml felülúszó folyadékhoz 24 ml 50 g 6000 molekulasúlyú polietilénglikol 100 ml vízzel készített vizes oldatát adjuk. 30 percig keverjük, az elegyet centrifugáljuk és a felülúszó pH értékét 1 n sósav hozzáadásával 4,8-ra állítjuk. Centrifugálás után a csapadékot 60 ml II pufferrel extraháljuk, a puffer összetétele a következő: 1,4% dinátrium-hidrogénfoszfát, 4,9% mono-nátrium-dihidrogénfoszfát, 1 n nátrium-hidroxiddal elkeverve, a pH = 7,0. 1 óra hosszat keverjük az elegyet, majd centrifugáljuk és a felülúszó folyadékot 60 ml telített ammónium-szulfát oldattal keverjük össze. Az elegyet ismét centrifugáljuk és a csapadékot 25 ml III összetételű oldatban oldjuk fel. A III oldat összetétele: 2% aminoecetsav, 0,25% nátriumhidrogénkarbonát. Az oldatot 79 cm hosszú és 2,5 cm átmérőjű Sephadex G 100 III oldattal egyensúlyozott oszlopra visszük. Az oszlopot a III oldattal eluáljuk és 260—320 ml elúciós térfogatnak megfelelő frakciókat szedünk. A kapott frakciók 260 egység emberi növekedési hormont tartalmaznak, melynek specifikus aktivitása minden mg proteinre 2,2 egység. 100 ß protein poliakrilamid gélen végzett elektroforézise csak 3 sávot mutat, ez megfelel a növekedési hormonnak és a dezamido-formáknak. 2. példa 250 mélyhűtött humán agyfüggelék-mirigyet az 1. példában leírt módon 1500 ml I pufferrel extrahálunk. A felülúszóhoz 460 ml 230 g polietilénglikolt (molekulasúlya 3000) és 270 ml vizet tartalmazó oldatot adunk. 20 percig keverjük és centrifugálunk, a felülúszó pH-ját 1 n sósavval 4,9-re állítjuk. 20 percig keverjük, centrifugáljuk, majd a csapadékot az 1. példában leírt módon 1000 ml II pufferrel extraháljuk. Egész éjjel keverjük, centrifugáljuk, majd 1000 ml telített ammónium-szulfát oldatot adunk a felülúszóhoz. Az elegyet ismét centrifugáljuk és a csapadékot 300 ml 126 g karbamidot és 207 ml III puffert (lásd 1. példa) tartalmazó oldatban feloldjuk. Az oldatot 100 cm hosszú, 11,4 cm átmérőjű, Sephadex G 100, III pufferrel egyensúlyozott oszlopra visszük. Az oszlopot a III pufferrel eluáljuk. A növekedési hormon elúciós térfogatának megfelelő frakciókat szedünk. A kapott frakciók 2900 egység növekedési hormont tartalmaznak, specifikus aktivitásuk minden mg proteinre 2,6 egység. 100/a poliakrilamid gélen végzett elektroforézise csak két sávot mutat, ez megfelel a növekedési hormonnak és a dezamido-formának. 3. példa 500 mélyhűtött agyfüggelék-mirigyet az 1. példában leírt módon 2000 ml I pufferrel extrahálunk. Centrifugálás után a pH-értéket 4,8-ra állítjuk. Az elegyet centrifugáljuk. A csapadékot tiszta növekedési hormonná dolgozzuk fel oly módon, hogy II pufferrel extraháljuk, kicsapjuk, ismét feloldjuk III pufferben és a 2. példában leírt módon oszlopkromatografáljuk. 3400 egysgényi növekedési hormont kapunk, melynek fajlagos aktivitása 2,7 g egység minden mg proteinre. A felülúszót 650 ml oldattal összekeverjük, az oldat 325 g polietilénglikol 3000-ből és 380 ml vízből áll. Az elegyet centrifugáljuk. A csapadékot II pufferrel extraháljuk, ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a III pufferrel ismét feloldjuk és a 2. példában leírt módon kromatografáljuk. A szedett növekedési hormon tartalmú frakciók 4230 növekedési hormon egységet tartalmaznak, a fajlagos aktivitás minden mg proteinre 2,6 egység. 500 agyfüggelék-mirigyből az össztermelés 7630 egység. 4. példa 500 mélyhűtött humán agyfüggelék-mirigyet az 1. példában leírt módon 2000 ml pufferrel extrahálunk. Centrifugálás után a pH-t 4,8-ra állítjuk. Az elegyet ismét centrifugáljuk. A felülúszót 1300 ml oldattal keverjük össze, amely 650 g polietilénglikolból (molekulasúlya 3000) és 760 ml vízből áll. Az elegyet centrifugáljuk. A csapadékot a II pufferrel extraháljuk és a 2. példában leírt módon ammónium-szulfáttal kicsapjuk. Az elegyet centrifugáljuk- 2000 ml felülúszó folyadékhoz 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
