175512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hipfizis szövetekből származó protein hormonok izolására és kinyerésére
3 175512 4 2. az extraktumot kicsapószerrel kicsapják és/vagy a pH-t 4,8-ra állítják, 3. a csapadékot semleges vagy savas pufferrel extrahálják, 4. az extraktumot ismételt kicsapásokkal és/vagy oszlopkromatográfiával pl. Sephadex Gloo-n gélszűréssel tisztítják. A fenti eljárás 2. lépésében kicsapószerként egyrészt ammónium-szulfátot használnak és ez szenynyezett végterméket eredményez, másrészt acetont alkalmaznak és ez oly mértékben denaturálja a proteineket, hogy nehezen oldhatók a következő extrakció során és így a termelés rossz lesz. A növekedési hormon minőségét a következő módszerekkel vizsgálják: Biológiai aktivitás (Tibia teszt), Greenspan, F. S. és társai: „Bioassay of hypophyseal growth hormone: the tibia test”, Endocrinology 45 (1949), 455-463. Immunológiai aktivitás (radiális immunodiffúzió), Mancini, G. és társai. „Immunochemical quatitation of antigens by single radial immunodiffusion”, Immunochemistry 2 (1965), 235—254, vagy rádió immunoteszt, Hansen, K. F.: „Radioimmunoassay of growth hormone in human plasma”, Acta Endocrinologica 71 (1972), 649—664. Gélszú'rés (polimerek vizsgálata), Schleyer, M. es társai: „Comparative Investigation of Different Human Growth Hormone Preparations”, Hormone and Metabolie Research 2 (1970), 174—180. Elektroforézis polikarbamid gélben (PAGE) idegen proteinek keresése), Orustein. L. Ann. NY. Acad. Sei. 121 (1964), 404 o. A biológiai aktivitást Tibia teszttel határozzuk meg: a WHO 1. szarvasmarha növekedési hormonra vonatkozó nemzetközi szabványa alapján. Az immunológiai aktivitást radioimmun kísérlettel határozzuk meg NBSB 1. nemzetközi emberi növekedési hormon referencia készítményre vonatkoztatva. Mivel a két meghatározás jól egyezik egymással, a következő példákban csak az „egység” fogalmat használjuk. A növekedési hormon tisztaságát úgy jellemezzük, hogy 1. a fehérje minden mg-ja nagyobb aktivitású, mint két nemzetközi egység, 2. több, mint 90% monomer formában fordul elő, 3. fehérje színezés után a 100 p-s PAGE csak olyan sávokat mutathat, amelyek a növekedési hormonnak vagy növekedési hormonnak és egy-két dezamido formájának felelnek meg. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy a hipofízis szövetek vizes extraktumát egy vagy több adat polietilénglikollal csapjuk ki 4—6 pH értéken és a polietiléngjikol mennyiségét úgy szabályozzuk, hogy a kívánt protein hormont vagy hormonokat frakciókban izoláljuk és a frakciókat önmagában ismert módon dolgozzuk fel és a protein hormonokat tiszta állapotban izoláljuk. Ha a kicsapást ily módon végezzük, akkor nagy termeléssel igen tiszta terméket kapunk. A polietilénglikol (PEG) szelektívebben hat, mint az ammóniumszulfát. A hipofízis hormonokat, különösen a növekedési hormonokat tisztább állapotban kapjuk, elkerülhetjük az aceton által okozott denaturálást is, és így a termelés is igen magas. A találmány szerinti módszert nemcsak a hipofízis extraktumoknál alkalmazhatjuk, hanem a peptid és protein hormonok pl. hipofízis szövetkultúrákból származó táptalajokból történő izolálására is. A találmány szerinti eljárás során a kicsapást előnyösen 4,5-5 optimális pH értéken végezzük polietilénglikollal. Különösen jó eredményeket érünk el, ha a pH 4,8. A találmány szerinti eljárásban használt polietilénglikol molekulasúlya előnyösen 3000—6000. Elvégezhető azonban az eljárás 6000-nél nagyobb és 3000-nél kisebb molekulasúlyú polietilénglikollal is. A legfontosabb hipofízis hormonok elválasztására és izolálására a találmány szerinti eljárás során az extraktumban lépésenként 0-ról 30%-ra (súly/térfogat) növelhetjük a polietilénglikol koncentrációját. Minden keverés után leszűrjük a csapadékot és így hatásosan elválasztjuk az egyes hipofízis hormonokat egymástól. Az egyes frakciókat ezután külön dolgozzuk fel és tiszta hormonokat kapunk. A találmány egyik előnyös foganatosítási módja szerint előnyös, ha a növekedési hormon kinyerésénél az extraktumból kicsapott frakciók elválasztását akkor végezzük, ha az extraktum 10—14% (súly/térfogat) polie tilénglikolt tartalmaz. Ily módon magas kitermeléssel kapjuk a kicsapott növekedési hormont, amelyet ismert módon tisztíthatunk. A leírt eljárásban kiindulási anyagként bármilyen hipofízis szövet extraktum vagy hipofízis hormonokat tartalmazó szövettenyészet alkalmazható. Az extraktumot ismert módon állítjuk elő, pl. darálással, aprítással vagy más finom aprítási módszerrel és vizes puffer oldattal való extrakcióval. Extrahálószerként előnyösen pH = 8—9, pl. 8,7 értékű vizes foszfát puffert alkalmazhatunk. Magasabb vagy alacsonyabb pH-értékű pufferrel is dolgozhatunk. Előnyös, ha a PEG-et pH = 8—9 értéken adjuk c a szűrt extraktumhoz, majd a pH-t 4,5—5,0-re, előnyösen 4,8-ra csökkentjük sav, pl. sósav, kénsav, foszforsav vagy ecetsav hozzáadásával. Az is lehetséges, hogy a PH-t először 4,5—5-re állítjuk és utána adjuk hozzá a PEG-et. Kívánt esetben a pH beállítását a PEG hozzáadásával egyidőben is végezhetjük. A PEG mennyisége a kicsapni kívánt hipofízis hormon mennyiségétől függ és lépésenként keverjük hozzá a PEG-et, ha maximális számú hipofízis hormon kicsapása a cél. így pl. a folyamatot elkezdhetjük 10% PEG hozzáadásával, az elegyet leszűrjük, a pH-t pl. 4,8-ra állítjuk. Szűrés után kívánt esetben egy vagy több adag PEG-et adhatunk hozzá, hogy az összes PEG mennyisége 14% legyen. A kapott frakciók jó termeléssel tartalmaznak növekedési hormont. További adagolás hatására más frakciókat, pl. FSH és LH hipofízis hormonokat tartalmazó frakciókat csapunk ki. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
