175339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az MM 17880 jelű ß-laktám-antibiotikum gyógyászatilag elfogadható dibázisos sóinak előállítására
7 175339 8 összetevő: Mennyiség (g/lit): CoCV6H20 0,001 csapvíz annyi, hogy a teljes térfogat 1 liter legyen A habzás megakadályozása céljából 300 ml 10%-os Pheronic L81-nek szójabab-olajjal készült elegyét adjuk a közeghez. A terméket 48 óra elteltével összegyűjtjük és centrifugálással tisztítjuk. A tisztított tenyészet aktivitását 340 egység/ml-nek találjuk (az egység megválasztása önkényes), ha a szokásos lemeztenyészet-módszerrel, Klebsiella aerogenes-el beoltott agaron mérjük. b) A legalább 75%-os tisztaságú MM 17880 izolálása dinátriumsója formájában Az a) lépésben előállított, 1050 liter térfogatú, 340 egy ség/ml aktivitású tisztított tenyészetet 10°C-on, 6,8-es pH-értéken 310 liter diklórmetánnal extraháljuk, 1200 g cetil-dimetil-benzil-ammóniumklorid jelenlétében, úgy, hogy a két folyadékot előre meghatározott áramlási sebességekkel áthajtjuk egy, a gyártási sorba iktatott, folytonos működésű keverőn. A fázisokat egy Sharpies folyamatos centrifugában (szállító cég: Pennwalt, Doman Road, Camberley, Surrey, England), körülbelül 2 percen át végzett centrifugálással különítjük el egymástól és a 300 liter térfogatú diklórmetán fázist vizes nátriumjodid-oldattal visszaextraháljuk. A visszaextrahálást négy lépésben végezzük, összesen 7 liter térfogatú, 210 g nátriumjodidot tartalmazó vizes oldatot használva fel. A fázisokat súly szerint elkülönítjük. A vizes fázis pH-értékét 7,7—7,0-ra állítjuk be sósav-oldattal és szűrjük. A 7 liter térfogatú nátriumjodid-extraktum 21 900 egység/ml hatóanyagot tartalmaz. 0,05 mól 7-es pH-értékű, 0,3 mól nátriumkloridot tartalmazó foszfát-pufferrel kezelt QAE Sephadex A25 ioncserélő gyantát (a Pharmacia Ltd. hozza forgalomba) egy 40 cm magasságú, 10 cm átmérőjű üvegoszlopba töltünk. A 7 liter térfogatú nátriumjodid-extraktumot 5 °C-on, 50 ml/perc áramlási sebességgel átfolyatjuk a QAE Sephadex oszlopon. Az oszlopot 0,05 mól foszfát-puffer és 0,7 mól nátriumklorid elegy ével eluáljuk, 7-es pH-értéken, szintén 5 °C-on, és 25 ml/perc áramlási sebességgel. 2 liter eluátumot elöntünk, és 90, egyenként 100 ml térfogatú frakciót összegyűjtünk. A frakciókat ultraibolya spektrofotométerrel analizáljuk, és azokat, melyek 285 nm hullámhossz környékén abszorpciós maximumot mutatnak, tehát, amelyek MM 17880-at és az ezt kísérd szennyező anyagokat tartalmazzák, összegyűjtjük, és pH-értéküket 7-re állítjuk be. Saját kísérleteinkben ezek a 25—35 frakciók voltak, és együttes térfogatuk 1230 ml-nek adódott, 8450 egység/ml aktivitást mutatva. 5 g/100 ml mennyiségben nátriumkloridot adunk az egyesített frakciókhoz, majd az oldatot áthajtjuk egy Amberlite XAD 4 (Rohm & Hass Ltd) gyantával töltött, 6,3 átmérőjű oszlopon, melyben a gyanta magassága 30 cm. Az áthajtás hőmérséklete 5 °C, az áramlási sebesség 20 ml/perc. Ilyen körülmények között az antibiotikum a gyantán adszorbeálódik, szemben a szervetlen szennyezésekkel, melyek nem adszorbeálódnak. Az antibiotikumot szobahőmérsékleten 200 ml desztillált vízzel, majd 50%-os metanollal eluáljuk. Az 1 liter térfogatú eluátumot 30 °C alatti hőmérsékleten, csökkentett nyomáson 70 ml térfogatra koncentráljuk, pH-értékét 7-re állítjuk be, és liofilizáljuk, amikor 2,18 g 5000 egység/mg aktivitású, barna szilárd anyagot kapunk. Kísérleteink során a fenti eljárással előállított anyag egy másik adagját valamivel tisztábbnak találtuk, aktivitása 5700 egység/mg volt. 0,55 mg mennyiségű szilárd anyagot az utóbbi, tisztább termékből egy 4x29 cm-es mikrokristályos cellulóz oszlopon kromatografálunk (Whatman CC 31), majd 4:1 arányú n-propanol-víz eleggyel egyenlítjük ki. Az oszlopot eluáljuk egy ugyanilyen összetételű eleggyel, az eluátum első 135 ml-ét elöntjük, majd a fennmaradó részt 15 ml-es frakciónként összegyűjtjük. Azokat a frakciókat, melyek az ultraibolya abszorpciós spektrum alapján MM 17880-at tartalmaznak, egyesítjük (45 ml), csökkentett nyomáson végzett párologtatással eltávolítjuk belőlük az n-propánok, majd liofilizáljuk őket. Ily módon 33 mg sárga szilárd anyagot kapunk, mely 16 000 egység/mg aktivitást mutat. 2. példa Az ebben a példában követett fermentációs és izolálási eljárások lényegében megegyeznek az 1. példában ismertetett megfelelő eljárásokkal az Amberlite XAD4 oszlopról végzett eluálással bezárólag. Az Amberlite XAD4 oszlopról lekerülő eluátumot csökkentett nyomáson körülbelül 20 ml-es térfogatra koncentráljuk. Ezt az oldatot felöntjük egy 3,8x30 cm-es QAE Sephadex A25 oszlopra, melyet 0,18 mólnátriumkloriddal készítettünk elő. Az oldatot kezdetben 0,18—0,28 mól, exponenciális gradiensű nátriumldorid oldattal eluáljuk, majd 2 liter teljes térfogat után az eluálást állandó, 0,28 mól koncentrációjú nátriumklorid-oldattal folytatjuk. Az oszlopot 4°C-on, 3 ml/perc sebességgel eluáljuk, és a frakciókat 25 ml-enként gyűjtjük össze. Az MM 17880-ra jellemző ultraibolya abszorpciós spektrummal rendelkező frakciókat (90—105) összegyűjtjük. E frakciók együttes térfogata 400 ml. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson körülbelül 10 ml térfogatra koncentráljuk, és 1%-os butanollal kiegyenlített 3,8x28 cm-es Biogel P2 (100-400 mesh) (Bio Rád Laboratories) oszlopra visszük fel. Az oszlopot 1%-os butanol-oldattal 2 ml/perc sebességgel eluáljuk, és 5 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. Azokat az MM 17880-ra jellemző ultraibolya abszorpciós spektrummal rendelkező frakciókat, melyek nem mutatják a klorid-ionokra jellemző ezüst-nitrát reakciót, összegyűjtjük. Az egyesített frakciókból vákuumban eltávolítjuk a butanolt, és a maradékot liofilizáljuk, amikor 73 mg amorf szilárd anyagot kapunk. 70 mg szilárd terméket feloldunk minimális mennyiségű, 4:1 arányú n-propand-víz elegyben, és az oldatot felvisszük egy 1,5x15 cm-es, Whatman CC 31, mikrokristályos cellulóz kromatográfiás oszlopra, melyet előzőleg ugyanezzel az oldószereleggyel kezel5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
