175306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új polipeptidek előállítására
175306 42 Aminosav-elçmzés: Lys: 1,02, Arg: 1,00, Thr: 1,00, Pro: 1,01, Gly: 2,00, Ala: 1,03, Tyr: 0,87, Phe: 2,04, (peptidtartalom: 78%). 41 22. példa H—Leu—Arg—Gly—Phe—Phe—Tyr—Gly—NH2 előállítása a) Z—Leu-Arg(Tos)-Gly—Phe—Phe-Tyr(Bzl)-Gly-gyanta előállítása Simadzu APS—800 típusú szilárd fázisú peptidszintetizátor reakciótankjába bemérünk 4,04 g BOC—Gly-gyantát (1,75 millimól Gly-t tartalmaz), majd a gyantát diklór-metánban 20 órán át duzzasztjuk. Ezután Merrifield módszere szerint eljárva egymásután 7—7 millimól BOC—Tyr(Bzl)—OH-t, BOC-Phe-OH-t, BOC-Phe-OH-t, BOC-Gly-OH-t, Aoc-Arg(Tos)-OH-t és Z-Leu-OH-t adagolunk. Kondenzálószerként DCC-t használunk, a BOC-csoportok lehasítását pedig trifluorecetsav és diklór-metán 1 : 1 arányú elegyével végezzük. Végül a gyantát a reakciótankból kivesszük, majd diklór-metánnal, dimetil-formamiddal, metanollal és ecetsavval mossuk, ezután pedig szárítjuk. így 5,07 g mennyiségben a cím szerinti gyantát kapjuk. b) Z-Leu-Arg(Tos)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)—Gly—NH2 előállítása 50 ml 17%-os metanolos ammónia-oldatban az a) lépésben kapott gyantából 4,41 g-ot szuszpendálunk, majd a szuszpenziót lezárt edényben szobahőmérsékleten 48 órán át keverjük. A gyantát ezután kiszűrjük, majd dimetil-formamiddal alaposan átmossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot összeöntjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékhoz dietilétert adunk, majd a képződött port kiszűrjük és dietiléterrel alaposan átmossuk. így a cim szerinti vegyületből 950 mg-ot kapunk. c) Leu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-NH2 előállítása 10 10 ml vízmentes hidrogén-fluoridban feloldunk a b) lépésben kapott nyers védett peptidamidból 500 mg-ot és 0,5 ml anizolt, majd a kapott oldatot 0 C-on 60 percen át keverjük. A hidrogén-fluoridot ezután ledesztilláljuk, majd a maradékot 50 ml vízben feloldjuk. A vizes oldatot kétszer 20 ml dietil-éterrel extraháljuk, majd 2 cm-szer 10 cm méretű, Amberlite IRA—410 márkanevű gyantából (acetát formájú) készült oszlopon átbocsátjuk és az eluátumot liofilizáljuk. A liofilizált terméket 2,3 cm-szer 17 cm méretű, karboximetil-cellulózból készült oszlopra fel visszük, majd az oszlopot 400 ml 0,005 mólos és 400 ml 0,2 mólos vizes ammónium-acetát-oldattal gradiens-eluálásnak vetjük 2lá- A 490 ml és 550 ml közötti frakciókat összegük, majd liofilizáljuk. így 167 mg fehér pelyhes csapadék formájában a cím szerinti vegyületet kapjuk. Aminosav-elemzés Arg: 1,02, Gly: 2,00, Leu: 1,03, Tyr: 0,89, Phe: 2,08 (peptidtartalom 84%). 23. példa H-(3-Ala-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Ala-Gly—NHj előállítása a) Z—0—Alá—Arg(Tos)—Gly—Phe—Phe—Tyr(Bzl)— —Alá—Gly-gyanta előállítása Simadzu APS—800 típusú peptidszintetizátor reakciótankjába bemérünk 3,03 g BOC-Gly-gyantát (1,32 millimól Gly-t tartalmaz) majd a gyantát diklór-metánnal duzzasztjuk. Ezután az ún. szimmetrikus anhidrid-eljárás [Hoppe—Seyler’s Z. Physiol. Chem., 353, 1973 (1972)] értelmében eljárva egymásután 6,5—6,5 millimól BOC—Alá—OH-t, BOC— —Tyr(Bzl)—OH-t, BOC-Phe-OH-t, BOC-Phe—OH-t, BOC—Gly—OH-t, Aoc—Arg(Tos)—OH-t és Z—ß—Ala—OH-t adagolunk. Minden egyes lépésben a BOC-csoportok lehasítását trifluorecetsav 50%-os diklór-metános oldatával végezzük. Ugyanakkor minden egyes lépesben a reakcióba nem lépett aminocsoportokat ecetsavanhidriddel acilezzük. Miután mindegyik aminosavat beadagoltuk, a gyantát a reakció tankból kiemeljük, majd etanollal, dimetil-formamiddal, diklór-metánnal, ecetsavval és metanollal mossuk, végül pedig csökkentett nyomáson szárítjuk. így 3,70 g mennyiségben a cím szerinti gyantát kapjuk. b) Z—/J—Alá—Arg(Tos)-Gly—Phe—Phe—Tyr(Bzl)— —Alá -Gly—NH2 előállítása 50 ml 17%-os metanolos ammónia-oldatba az a) lépésben kapott gyantából 3,28 g-ot szuszpendálunk, majd a szuszpenziót lezárt edényben szobahőmérsékleten 40 órán át keverjük. Ezután a gyantát kiszűrjük és 50 ml dimetil-formamiddal mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot összeöntjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz dietilétert adunk, majd a képződött port kiszűrjük és szárítjuk. így 433 mg mennyiségben a cím szerinti vegyületet kapjuk. c) H—0—Ala—Arg—Gly—Phe—Phe-Tyr—Ala-Gly-NH2 előállítása 8 ml vízmentes hidrogén-fluorid és 0,3 ml anizol elegyében feloldunk a b) lépésben kapott nyers védett peptidamidból 310 mg-ot, majd a kapott oldatot 0 °C-on 60 percen át keverjük. Ezután a hidrogén-fluoridot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, majd a maradékot 50 ml vízben feloldjuk. A vizes oldatot kétszer 10 ml dietiléterrel extraháljuk, majd 1 cm-szer 10 cm méretű, Amberlite IRA—410 márkanevű gyantából (acetát formájú) készült oszlopra felvisszük. Az oszlopot vízzel mossuk az eluátum átfolyása után. Az eluátumot és a mosófolyadékot összeöntjük, majd liofilizáljuk. A liofili-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
