175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
19 175266 20 FLÉE) desztillált vízben tartalmazó táptalajban szuszpendálunk. A tenyészetet éjszaka rotációs rázóberendezésben 28 °C-on inkubáljuk. Ezzel a tenyészettel oltjuk be az 1,5%-os agar fenti összetételű FLÉE-vei képezett elegyét tartalmazó ferde tenyészetek felületét és a beoltott ferde tenyészeteket 28 °C-on inkubáljuk éjszaka és jégszekrényben tároljuk. Egyetlen liofilizált tenyészetből előállított hűtött ferde tenyészetet az elkészítéstől számított négy hétig használunk a következők szerint: A ferde tenyészet egy kristályát egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 50 ml FLÉE-ben diszpergáljuk. A tenyészetet éjszaka rotációs készülékben 28 C-on inkubáljuk, majd olyan sűrűségre hígítjuk, hogy 660nm-nél az áteresztőképessége 50%-os legyen. A hígított tenyészet 33,2 ml-es adagját hozzáadjuk 1 liter 15 g agart tartalmazó FLÉE oldathoz és a hőmérsékletet 46 °C-on tartjuk. A beoltott agar-tartalmú közeget 100xl5mm-es műanyag Petri-csészékbe öntjük, edényenként 5 ml-t, majd lehűtjük és használat, előtt legfeljebb öt napig 2—4 °C-on tartjuk. A Salmonella gallinarum MB-1287 tenyészeteket a következő módon állítjuk elő: Fölözött tejben Salmonella gallinarum sejteket megfagyasztunk, liofilizálunk és a kémcsövet vákuumban beforrasztjuk, majd a kémcsövet felnyitjuk és a tartalmát 15 ml agy-szív infúziós táptalajba oltjuk. A sejteket rázás nélkül hagyjuk nőni 37 °C-on egész éjjel, majd a tenyészetet átoltjuk 0,8,w BBL táptalaj+0,2% Difco élesztő kivonat+1,5% agar összetételű fade tenyészetekbe. 37 C-on hagyjuk nőni éjjel, majd a tenyészet egy cseppjét átvisszük a ferde tenyészetből ^0 ml 0,8% fermentlevet+0,2% élesztőkivonatot tartalmazó lombikba. A lombikot egész éjjel zzuk, majd ennek a tenyészetnek 20 ml-ét 1 lit előzőleg sterilizált es 48 °C-ra hűtött 0,8% táptalajt, 0,2% élesztőextraktumot és 1,5% agart tartalmazó elegybe oltjuk. A beoltott FLÉE agart 5 ml-ként azonnal 100 x 15 mm-es Petri-csészékbe öntjük és ? csészéket felhasználásig 0-3 °C-on tartjuk. 1.27 cm-es átmérőjű szűrőpapír lemezeket a vizsgálandó oldatba mártunk és az agarra helyezünk. Úgy is eljárhatunk, hogy a száraz lemezekre egy tized ml oldatot pipettázunk, majd a lemezeket az agarra helyezzük. A megfelelő inkubálás után(9-18 óra 37 °C-on Sannondla gallinarum MB -1287 esetén, vagy 12—24 óra 25 °C-on Vibno percolans ATC C í]4ol esetén) mérjük a gátlási zóna átmérőjét. Szükség esetén a vizsgálandó oldatokat 0,05 M kálium-foszfát pufferrel (pH - 7,4, a kálium-foszfát puffer a iovábbiakban KFP-ként szerepel) vagy ionmentes vízzel hígíthatjuk. A hatásosságot a következőképpen számítjuk ki: a differenciálhányadost a 890 Ai és a 890 A3 antibiotikumok és egy négyszeres KFP liígítású oldat gátlási zónáinak átmérőinek mérésével határozzuk meg. Mindegyik koncentráció két lemezét egy csészében elemezzük és meghatározzuk az egyes koncentrációk átlagos zóna méretét. A differenciálhányados megfelel az átlag zóna méretek különbsége felének. A hatást a következő képlet szerint számíthatjuk ki: hatás (egység/ml) = (D-Ds) log 2 differenciálhányados (sztandard hatása) x hígítás x 10 - ahol D a meghatározandó anyag zónáinak átlagos átmérője D, a sztandard zónák átlagos átmérője és a „hígítás” a meghatározandó oldat kísérlet előtti hígítási mértéke. Ha nem használunk sztandardot, D, feltételezett értéke 25 mm és a sztandard hatékonyságát 1 egység/ml-nek vesszük, ha a Vibrio percolans ATCC 8461-n mérjük. A tiszta 890 At definíció szerint 300 nm-nél 250 egység/hidroxilamin kioltási abszorpciós egységet mutat, ha sztandardként alkalmazzuk. Ennek megfelelően a 890 A3 hatásossága 300 nm-nél 31 egység/hidroxilamin kioltási abszorpciós képesség egység. A Salmonella gallinarum MB-1287 tenyészetekkel végzett kísérletekhez a differenciálhányadost hasonlóképpen határozzuk meg, mint a Vibrio percolans ATCC 8461 esetében. Ha nem használunk sztandardot, csak viszonylagos hatást számítunk. Ha nem mérünk differenciálhányadost, a feltételezett érték 2,3 mm. A hatékonyság számításokat ugyanúgy végezzük, mint a Vibrio percolans ATCC 8461 elemzésnél. Ha nem használunk 890Ai sztandardot, kontrollként alkalmazhatunk 250 pg/ml mennyiségű penicillin G-t annak ellenőrzésére, hogy az organizmusok érzékenysége normális határok között van-e. II „890 kísérleti egységek” meghatározásának módszere A szokásos lemez-diffúziós módszert használjuk és a lemezek 1,27 cm átmérőjűek. Vibrio percolans (ATCC 8461) törzzsel beoltott szokásosan öntött 10 ml/tenyészetet alkalmazunk és a sztandard cefaloridin. A sztandard négy féle koncentrációjú cefaloridinből áll: 3,12, 6,25, 12,5 és 25 meg/ml és a referenciaként szolgáló oldat koncentrációja 12,5 mcg/ml. 5 ml-es sztandard tenyészet esetében a zóna átmérők a következők: koncentráció (mcg/ml) zóna átmérő (mm) 3,12 16,8 6,25 22,3 12,5 25,0 25 29,6 Egységesen értjük az antibiotikum azon mennyiségét, amely egy 5 ml-es tenyészeten egy 25 mm-es gátlási zónát képez. így ebben a kísérletben 12,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
