175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
21 175266 22 meg/ml cefaloridint 1 egység 890 A-val tekintünk ekvivalensnek. Mivel a cefaloridin vonalának differenciálhányadosa 4, a minta aktivitásának számításánál differenciálhányadosként 4-et veszünk. 111 Hidroxilamin reakció A 890 Ai és a 890 A3 antibiotikum is reagál hidroxilaminnal és erősen csökkentett abszorpciójú anyagot kapunk 300 nm-nél. Ez szolgáltatja a 890 A] és 890 A3 antibiotikumok kvantitatív elemzésének alapját. A vizsgálandó oldatot 0,05 M kálium-foszfátba vezetjük és a pH-t 0,8 M kálium-hidrogénfoszfátot és 0,2 M kálium-dihidrogénfoszfátot tartalmazó egy huszadnyi térfogatú oldat hozzáadásával 7,4-re állítjuk. Ezután egy századnyi térfogat 1 M hidroxilamin-hidrokloridot adunk hozzá és az abszorpciót 300 nm-nél félórától kétpercig terjedő időközökben mérjük. A reakciót 22—28 °C-on folytatjuk. Elsőrendű reakciókinetikát feltételezünk és a felezési időt az első tíz perc alatt bekövetkező abszorpció-képesség csökkenéséből becsüljük meg. Ebből a felezési időből megbecsüljük azt az időt, amelyen túl már nem szabad további abszorpció-képesség csökkenést észlelni és a megfigyeléseket ez időn túl is folytatjuk. Ha már nem tapasztalunk további csökkenést, az összes abszorpciócsökkenést (beleszámítva a hígítási hatásra és a hidroxilamin abszorpciójára végzett korrekciót) vesszük a „hidroxilamin kioltási abszorpció-képességnek 300 nm-nél”. Ha ezután is tapasztalunk csökkenést az abszorpció-képességben, leszámítjuk a háttéri abszorpció csökkenés sebességét és az abban az időben észlelt abszorpciót korrigáljuk a háttéri csökkenésre, feltételezve, hogy a háttéri csökkenés egyenesen arányos az idővel. Ezt a korrigált értéket jegyezzük fel tehát a hidroxilamin kioltási abszorpciós képességnek 300 nm-nél (HKAK30o)A HKAK30o egységek száma egyenlő HKAK30o x ml-ben mért térfogat. 1. példa N-acetil-tienamicin amidohidroláz termelő törzsek izolálási módszere lg gyeptalaj 100ml steril foszfát-puffer konyhasó oldatban történő szuszpendálásával 1 súly/térfogat%-os termékeny gyeptalaj szuszpenziót készítünk. A foszfát-puffer konyhasó oldat összetétele a következő: Foszfát puffer-konyhasó oldat nátrium-klorid 8,8 g 1M foszfát puffer pH = 7,5 10 ml desztillált víz 1000 ml. 1M foszfát puffer, (pH = 7,5) előállítása 16 ml 1M kálium-dihidrogénfoszfátot 84 ml 1M dikálium-hidrogénfoszfáttal keverünk össze. A foszfát puffer pH értékét kis mennyiségű 1M kálium-dihidrogénfoszfát vagy 1M dikálium-hidrogénfoszfát hozzáadásával 7,5-re állítjuk be. A fenti 1%-os talaj szuszpenziót alapul használjuk lOx, lOOx és lOOOx hígítású alikvotok előállítására. Az alapszuszpenzió 1 ml-ét vagy a lOx, lOOx és az 1000x-es hígítású oldatok 1 ml-ét steril, 1% agar oldatok 2 ml-es adagjaihoz öntjük 48 °C-on. Az elegyeket gyorsan a 20 ml A táptalajt tartalmazó 85 mm átmérőjű steril Petri-csészék felületére öntjük. Az A táptalaj összetétele a következő: kálium-dihidrogénfoszfát 3,0 g dikálium-hidrogénfoszfát 7,0 g magnézium-szulfát 0,1 g desztillált víz 1000 ml N-acetiletanol-amin oldat 8,5 ml. Az N-acetil-etanolamin oldat előállítása úgy történik, hogy az N-acetiletanolamint 10x-szeres mennyiségű vizzel hígítjuk és membrán-sterilizáljuk. Az oldatot csírátlanítás után adjuk hozzá. Szilárd táptalajnál még 20 g agart adunk hozzá. A Petri-csészéket 18 napig inkubáljuk 28 °C-on. Jól izolált telepeket választunk ki és B táptalajra visszük fel. A B táptalaj összetétele a következő: B táptalaj paradicsompép 40 g őrölt zabliszt 15 g desztillált víz 1000 ml. pH: nátrium-hidroxid hozzáadásával 6-ra állítjuk be. Szilárd, közegeknél 20 g agart adunk hozzá. Egyes kiónokat kiválasztunk és 2 napig hagyjuk növekedni 28 °C-on B táptalaj ferdetenyészeteken. A ferdetenyészetek növekményének egy részét arra használjuk, hogy egy 50 ml A táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot, egy csírátlanítás után 0,4 ml vízzel tízszeresére hígított membrán-sterilizált N-acetiletanolamin oldattal kiegészített 50 ml B táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot és egy 50 ml C táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot beoltsunk vele. A C táptalaj összetétele a következő: C táptalaj dextróz 20 g Pharmamedia 8 g kukoricalekvár (nedves bázis) 5 g desztillált víz 1000 ml. nátrium-hidroxid vagy sósav hozzáadásával apH-t 7-re igazítjuk. N-acetiletanolamin oldat 8,5 ml. Az N-acetiletanolamin oldatot a következőképpen állítjuk elő: Az N-acetiletanolamint vízben a tízszeresére hígítjuk és membrán-sterilizáljuk. Ezt az oldatot csí5 10 15 20 25 10 35 40 45 50 55 60 65 11
