175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
17 175266 18 edényenként 5 ml-t, majd lehűtjük és használat előtt legfeljebb öt napig 2—4 °C-on tartjuk. A Staphylococcus aureus ATCC 6538 P törzset tartalmazó tenyészeteket a következőképpen állítjuk elő: A Staphylococcus aureus ATCC 6538 P teszt-organizmus egy éjjelen keresztül létrejött növekményét fermentlé + 0,2% élesztőextraktum elegyben fermentlé + 0,2% élesztőextraktum eleggyel hígítjuk oly mértékben, hogy 660 nm-hullámhossznál 55%-os áteresztőképességű szuszpenziót kapjunk. A szuszpenziót 2,0 g (1 Difco-élesztőextraktummal kiegészített Difco táp-agarhoz adjuk 47-48 °C-on és így 1 liter agarban 33,2 ml szuszpenziót tartalmazó készítményt kapunk. Ennek a szuszpenziónak 5 ml-ét 85 mm átmérőjű Pttri csészékbe öntjük, a csészéket lehűtjük és felhasználásig maximum öt napig 4 °C-on tartjuk. Az elemezni kívánt antibiotikum mintákat foszfát-pufferben pH = 7 értéken megfelelő koncentrációra hígítjuk. 0,63 és 1,27 cm-es átmérőjű szűrőpapír lemezeket mártunk a teszt-oldatba és a teszt-tenyészet felületére helyezzük. A tenyészeteket 37 °C-on éjszaka inkubáljuk és a gátlási zónát mm-kben mérve meghatározzuk a relatív hatékonyságot. II. Hidroxilamin-kioltási abszorpció képesség A 301 nm-nél mért abszorpció képességet — amely a szennyezett minták antibiotikum tartalmának tulajdonítható — az abszorpció képesség szelektív extinkciójával határozzuk meg híg hidroxilaminnal történő reakcióval (az antibiotikum hatása egyidejűleg inaktiválódik) A mintákat 0,01 M kálium-foszfát pufferban pH = 7 értéknél állítjuk elő oly módon, hogy a kezdeti 301 nm-nél mért abszorpció (A30i) 0,1-1 között legyen. Frissen készített semleges hidroxilamint adunk hozzá (hidroxilamin-hidroklorid + nátrium-hidroxid, végső pH = 7), míg a minta végső koncentrációja 10 mM lesz. A reakciót legalább 30 percig hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten. A kapott A30i értéket a (hozzáadott reagenssel történt hígításra korrigált (kezdeti leolvasási értékből kivonva, a hidroxilamin-kioltási abszorpció képességet kapjuk. A tiszta N-aeetil-tienamicin oldatok 96%-os hidroxilamin-kioltási abszorpció képességet mutatnak. Tienamicin elemzése I. Bioelemzés A következőkben ellenkező megjegyzés hiányában mindig lemez-diffúziós módszerrel végezzük el az antibakteriális aktivitás meghatározását. A próba-tenyészeteket a következő módon készítjük. 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó táptalajban a vizsgálandó törzs Staphylococcus aureus ATCC 6538 P egy éjszaka alatt kialakult növekményét 0,2% élesztő kivonatot tartalmazó táptalajjal hatjuk és 660/rm hullámhossznál 55% áteresztőképességű szuszpenziót kapunk. Ezt a szuszpenziót 2,0 g/liter Difco élesztőkivonattal kiegészített Difco táp-agarhoz adjuk 47—48 °C-on és így a készítmény 33,2 ml szuszpenziót tartalmaz 1 liter agarra számítva. A szuszpenzió 5 ml-ét 85 mm átmérőjű Petri-csészékbe öntjük, majd ezeket a tenyészeteket hűtjük és a használat napjáig (max. 5 napig-) 4 °C-on tartjuk. Az antibiotikum mintákat pH = 7 értékű foszfát-pufferben a megfelelő koncentrációra hígítjuk. 12,7 mm átmérőjű szűrőpapírlemezeket a teszt-oldatba mártunk, majd a próbatenyészet felületére helyezzük. Minden mintához általában 2 lemezt helyezünk el, egymással szemben egy tenyészetre. A tenyészeteket éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, majd megmérjük a gátlási zóna átmérőt mm-ben. A mm-ben mért gátlási zóna relatív aktivitást ad meg, vagy ha a tisztított referencia-sztandarddal összehasonlítjuk, például cefalotinnal, akkor egység/ml-ben kapjuk az antibiotikum aktivitását. A 4—7. példákban az aktivitás egységét a cefalotin 8,4,2 és lp/ml koncentrációjú sztandard adataihoz viszonyítjuk. Egy egység definíciója: az a mennyiség, amennyi ugyanolyan gátlást hoz létre, mint 1 jug cefalotin/ml, ennek a gátlási zónának az átmérője 16-21 mm. II. Hidroxilamin-kioltási abszorpció-képesség A 297 nm-nél mért abszorpció-képességet — amely a szennyezett minták antibiotikum tartalmának tulajdonítható - az abszorpció-képesség szelektív extinkciójával határozzuk meg híg hidroxilaminnal történő reakcióval (az antibiotikum hatása egyidejűleg inaktiválódik). A mintákat 0,01 M kálium-foszfát pufferban pH = 7 értéknél állítjuk elő oly módon, hogy a kezdeti 297 nm-nél mért abszorpció (A297) 0. 05-2 között legyen. Frissen készített semleges hidroxilamint adagolunk (hidroxilamin-hidroklorid + nátrium-hidroxid, végső pH = 7), míg a minta végső koncentrációja lOmM lesz. A reakciót legalább 30 percig hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten. A kapott A297 értéket a (hozzáadott reagenssel történt hígításra korrigált) kezdeti leolvasási értékből kivonva, a hidroxilamin-kioltási abszorpció képességet kapjuk. A tiszta N-acetil-tienamicin oldatok 94,5%-os hidroxilamin-kioltási abszorpció-képességet mutatnak. 890 Aj és 890 A3 elemzési módszerei 1. Bioelemzés Agár-lemez diffúziós módszert alkalmazunk Vibrio percolans ATCC 8461 vagy Salmonella gallinarum MB—1287 teszt-organizmusok felhasználásával. Sztandardként 890 A! antibiotikum egy tisztított mintáját használjuk. A Vibrio percolans ATCC 8461 törzset tartalmazó lemeztenyészeteket a következőképpen állítjuk elő: Vibrio percolans ATCC 8461 liofilizált tenyészetet 15 ml sterilizált 8 g/liter Difco fermentlevet és 2 g/liter élesztőextraktumot (következőkben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
